滕新棟，陳曉光，姜 華，顧長美，朱 可

(1.山東國際旅行衛(wèi)生保健中心， 山東 青島 266000； 2.威海出入境檢驗檢疫局， 山東 威海 264200)

microRNAs(miRNAs)是一類微小、非編碼和高度保守的單鏈RNA，可通過靶向信使RNA(mRNA)特異地調(diào)節(jié)基因表達。它具有多種生物學(xué)功能，在腫瘤、糖尿病和感染性疾病等多種疾病中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。研究表明，血清或血漿中的循環(huán)miRNAs可作為篩選結(jié)核病(tuberculosis,TB)的重要靶標。

肺TB是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，嚴重威脅著人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，2015年有1 040萬新發(fā)TB病例，全球人口1/3感染M.tb(M.tuberculosis)[1]。鑒于TB的嚴重程度和TB診斷方法的發(fā)展情況，早期診斷對控制肺TB至關(guān)重要，但是目前沒有有效的診斷肺TB的靶標。因而，需要發(fā)展全新、快速、敏感和有效的標志物來診斷肺TB。

本研究旨在利用高通量測序和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)探討肺TB患者和健康人血漿中miRNAs的差異表達情況，發(fā)現(xiàn)有診斷價值的miRNAs種類，為后續(xù)TB診斷試驗和機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:選取青島市黃島區(qū)結(jié)核病防治所的肺TB患者5例，選取標準為痰涂片陽性或痰培養(yǎng)陽性。選取山東國際旅行衛(wèi)生保健中心的健康人5名，選擇標準為T-SPOT.TB陰性，無TB及其他疾病史，未接觸過TB患者。所有研究對象均閱讀并簽署知情同意書，該研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑:Trizol?Reagent、6% Novex TBE PAGE gel(1.0 mm，10 well)和TBS380 Picogreen(Invitrogen公司)；miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒和2×SG Fast qPCR Master Mix[生工生物工程(上海)股份有限公司)]；TruseqTMSmall RNA sample prep Kit、HiSeq 4000 PE Cluster Kit、HiSeq 4000 SBS Kit(300 cycles)和MiSeq Reagent Kits v3(600 cycles)(Illumina公司)；Certified Low Range Ultra Agarose(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 標本收集:用EDTA抗凝的旋蓋采血管收集肺TB患者和健康人的全血樣本10 mL，上下顛倒混勻后，3 600×g低溫離心5 min，將血漿收集到無RNase/DNase的離心管中，12 000×g低溫離心2 min，將上層血漿收集到無RNase/DNase的離心管中，每管保存0.5 mL。將分裝好的血漿置于-80 ℃保存待用。

1.2.2 RNA提取和檢測:肺TB患者和健康人的血漿中RNA提取和檢測委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。用試劑盒提取血漿中總RNA，無RNase水充分溶解總RNA。使用NanoDrop2000檢測RNA純度和濃度，以及Agilent2100檢測RIN值。

1.2.3 高通量測序分析miRNAs表達譜:委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina Hiseq 4000測序平臺完成。具體流程如下：分別連接3′端接頭和5′端接頭；隨機引物反轉(zhuǎn)成1 st Cdna；文庫富集(PCR 11～12個循環(huán))；文庫純化(6% Novex TBE PAGE gel，1.0 mm，10孔)；TBS380(Picogreen)定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機；cBot上進行橋式PCR擴增，生成clusters；Hiseq測序平臺，進行SE50測序；最后進行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 RT-qPCR檢測miRNAs表達:將血漿中提取的miRNA按miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按2×SG Fast qPCR Master Mix(High Rox)試劑盒說明書操作進行RT-qPCR。hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p、hsa-miR- 93- 5p和hsa-let- 7g- 5p的引物F分別為5′-CGCTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTT-3′、5′-ACCACTAGAT TGTGAGCTCCTGGA-3′、5′-ACAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTA G-3′和5′-CGCGCTGAGGTAGTAGTTTGTACAGTT-3′。小核RNA U6作為內(nèi)參基因， 通用反向引物作為所有基因的反向引物。miRNA的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。t檢驗比較兩組miRNA表達譜的差異，P<0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序篩選肺TB患者和健康人血漿中miRNAs的差異表達：與健康人相比，肺TB患者血漿中有79種miRNAs差異表達，其中有54種miRNAs表達上調(diào)，有25種表達下調(diào)。血漿miRNAs表達上調(diào)倍數(shù)在2.02～16.10(表1)，表達下調(diào)倍數(shù)在2.19～15.16之間(表2)。

表1 肺TB患者和健康人血漿中miRNAs表達上調(diào)情況Table 1 Over-expression of miRNAs in the plasma of pulmonary TB and health people

表2 肺TB患者和健康人血漿中miRNAs表達下調(diào)情況Table 2 Down-expression situation of miRNAs in the plasma of pulmonary TB and health people

2.2 RT-qPCR證實miRNAs表達：選取hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p、hsa-miR- 93- 5p和hsa-let- 7g- 5p進行RT-qPCR驗證，2-△△Ct值分別為3.05±0.30、3.61±0.45、1.75±0.15和0.52±0.06。RT-qPCR證實miRNAs表達與高通量測序結(jié)果一致，相比于健康人，肺TB患者hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p和hsa-miR- 93- 5p表達上調(diào)，而hsa-let- 7g- 5p表達下調(diào)。

3 討論

血漿中miRNAs具有許多優(yōu)點，如對時間溫度變化的影響小、穩(wěn)定性好、抗酶降解、抗酸堿等，是1種對于疾病的診斷、治療和預(yù)后有重要意義的生物標志物。本研究成功篩選出79種肺TB患者血漿中差異表達的miRNAs，其中有54種miRNAs表達上調(diào)，有25種表達下調(diào)，并且證實了hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p和hsa-miR- 93- 5p表達上調(diào)，而hsa-let- 7g- 5p表達下調(diào)。

近年來， miRNAs診斷TB的研究是1個熱點問題，也發(fā)現(xiàn)了一些有意義的標志物。與健康人相比：用高通量測序發(fā)現(xiàn)91種miRNAs在TB患者血清中差異表達，RT-qPCR證實TB患者血清中hsa-miR- 22、hsa-miR- 29c、hsa-miR- 378和hsa-miR- 483- 5p表達上調(diào)，而hsa-miR- 101和hsa-miR- 320b表達下調(diào)，并且此6種miRNAs聯(lián)合敏感度和特異度更高，更適于診斷TB[2]；用高通量測序發(fā)現(xiàn)TB患者血清中24種miRNAs表達上調(diào)和6種miRNAs表達下調(diào)，RT-qPCR證實hsa-miR- 196b和hsa-miR- 376c可診斷TB[3]；利用微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)TB患者血清的92種miRNAs中差異表達，miR- 29a和miR- 93*在TB患者血清中表達均上調(diào)[4]。本研究利用高通量測序技術(shù)分析了肺TB患者和健康人血漿中的miRNAs表達譜，獲得了大量miRNAs差異表達的信息，并選取幾種miRNAs成功用RT-qPCR證實表達。

總之，本研究篩選出多種miRNAs差異表達，hsa-let- 7i- 5p、hsa-miR- 28- 3p、hsa-miR- 93- 5p和hsa-let- 7g- 5p可作為診斷肺TB潛在的標志物，為后續(xù)肺TB診斷實驗和機制研究的開展奠定了基礎(chǔ)。