針刺尿三針對(duì)BPH大鼠前列腺細(xì)胞凋亡的影響*

王梓楠，方浩泰，袁 青

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006)

良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia,BPH)是中老年男性最為常見的泌尿外科疾病之一。BPH的普遍性高，發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)逐漸上升。有文獻(xiàn)報(bào)道[1]，40～49歲群體BPH的發(fā)生率13. 8%，50～79歲群體BPH的發(fā)生率接近40%，80歲群體BPH的發(fā)生率超過80%，嚴(yán)重影響老年男性的生活質(zhì)量。臨床以尿三針為主，根據(jù)臟腑經(jīng)絡(luò)辨證配以相應(yīng)配穴治療BPH具有顯著療效。目前，針刺治療BPH的臨床觀察研究頗多，肯定了針灸治療BPH具有顯著療效，這些研究多采用西藥治療作為對(duì)照組進(jìn)行研究。如陳雷[2]等將針灸治療BPH與口服西藥進(jìn)行對(duì)比，認(rèn)為針灸治療療效優(yōu)于口服鹽酸特拉唑嗪片。魏旭[3]等通過對(duì)針灸治療前列腺炎臨床文獻(xiàn)的研究，使用頻率最高的穴位與尿三針完全一致。本文旨在通過觀察尿三針對(duì)前列腺增生大鼠的前列腺濕重、前列腺指數(shù)(PI)、組織形態(tài)、前列腺細(xì)胞凋亡情況的影響，從細(xì)胞凋亡角度對(duì)尿三針治療BPH的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討，闡述針灸治療BPH的內(nèi)在機(jī)制，為臨床針刺治療BPH提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

成年雄性SPF級(jí)SD大鼠18只，體質(zhì)量(270±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(粵)2016- 0041)，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究所。

1.2 藥物與試劑

丙酸睪酮注射液(1 ml:25 mg)購(gòu)于上海通用藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)131208)；Tunel染色試劑盒購(gòu)于羅氏公司(Roche，貨號(hào)11684817910)；蘇木素染液和伊紅染液購(gòu)于碧云天公司。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡由日本尼康公司生產(chǎn)(型號(hào)NIKON ECLIPSE ci-l)；成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)；光學(xué)顯微鏡由日本尼康公司生產(chǎn)(型號(hào)NIKON ECLIPSE ci)；成像系統(tǒng)(Nikon digital sight ds-fi2)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將18只大鼠標(biāo)記稱重后，隨機(jī)區(qū)組分為正常組、模型組、尿三針組3組各6只。

1.4.2 模型制備 模型組與尿三針組皮下注射丙酸睪酮5 mg/kg·d，連續(xù)28 d；正常組皮下注射相應(yīng)體積的橄欖油，連續(xù)28 d，大鼠每天注射前稱重計(jì)算注射藥物量。

1.4.3 干預(yù)方法 造模完成后第1天即進(jìn)行干預(yù)，將大鼠仰臥固定在固定器上，使用0.18×10 mm一次性無(wú)菌針灸針(華佗牌，蘇州，中國(guó))，尿三針組針刺尿三針穴組，關(guān)元向下斜刺3 mm，中極向下斜刺3 mm，三陰交直刺3 mm，留針15 min，各穴每5 min捻轉(zhuǎn)1次，每日1次，連續(xù)21 d，模型組與正常組固定相同時(shí)間。

1.4.4 前列腺指數(shù)測(cè)定 于末次干預(yù)后，禁食12 h，稱空腹大鼠體重后以7%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，大鼠麻醉成功后將其固定在手術(shù)臺(tái)上，手術(shù)完整摘取前列腺組織，去掉周圍脂肪組織。用電子天平精確測(cè)量前列腺濕重，計(jì)算大鼠前列腺指數(shù)：PI=前列腺濕重mg/大鼠體質(zhì)量g。

1.4.5 tunel染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞 10%福爾馬林固定大鼠前列腺，石蠟包埋、切片。石蠟切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲(chǔ)存液用PBS1∶9稀釋)覆蓋組織，37℃溫箱孵育30 min。將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按2∶29混合，滴加覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37 ℃水浴鍋孵育2 h，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。切片用PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5 min。去除PBS后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果DAPI染的細(xì)胞核在紫外線激發(fā)下為藍(lán)色，Roche試劑盒為FITC熒光素標(biāo)記，陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為綠色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取標(biāo)記相同的綠色熒光細(xì)胞核作為判斷所有照片陽(yáng)性細(xì)胞的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，選取標(biāo)記相同的DAPI藍(lán)色細(xì)胞核為其他細(xì)胞，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及總細(xì)胞數(shù)。計(jì)算大鼠前列腺細(xì)胞凋亡率：凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.6 HE染色法觀察前列腺組織形態(tài) 石蠟切片脫蠟至水，切片放入Harris蘇木素染3～8 min，用自來水沖洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色1～3 min,將染色后的切片脫水后用中性樹膠封片,切片于尼置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果細(xì)胞核等堿性物質(zhì)染為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)及分泌物等酸性物質(zhì)染為粉紅色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫落

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠共18只，全部進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)脫落。

2.2 各組大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)情況

表1顯示，與正常組比較，模型組和尿三針組前列腺濕重及前列腺指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，尿三針組前列腺濕重及前列腺指數(shù)明顯降低(P<0.05)。

2.3 HE染色結(jié)果

圖1顯示，正常組大鼠前列腺上皮為單層柱狀或立方狀，腺上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核位于基底部呈圓形，腺腔規(guī)則平整，腺腔內(nèi)充滿大量粉紅染酸性分泌物，無(wú)纖維組織增生。模型組大鼠前列腺上皮細(xì)胞為高柱狀呈簇狀增生，排列緊密，細(xì)胞核變大呈圓形或橢圓形，可見腺上皮細(xì)胞增生向腺腔內(nèi)形成凸起，腺腔變小甚至關(guān)閉，腺腔內(nèi)無(wú)粉紅染酸性分泌物，有大量纖維組織增生。尿三針組大鼠前列腺上皮為柱狀，少量為高柱狀，部分排列整齊，細(xì)胞核呈圓形；腺上皮細(xì)胞增生向腺腔內(nèi)形成少量凸起，腺腔輕度變小，腺腔內(nèi)有粉紅染酸性分泌物稍減少，有少量纖維組織增生。

2.4 tunel染色法檢測(cè)各組大鼠前列腺細(xì)胞凋亡情況

表1圖2顯示，尿三針組的凋亡率明顯高于正常組與模型組(P<0.05)；模型組與正常組凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)及細(xì)胞凋亡情況比較

注：與正常組比較：aP<0.05；與模型組比較：bP<0.05

圖1 使用HE染色觀察各組大鼠前列腺組織形態(tài)(HE×100)

圖2 使用tunel染色法觀察個(gè)小組前列腺細(xì)胞凋亡情況(tunel×200)注：白色箭頭所指為凋亡細(xì)胞

3 討論

BPH是由于前列腺間質(zhì)和腺體的增生而導(dǎo)致解剖學(xué)上前列腺體積增大、壓迫尿道，使尿道變形、狹窄，從而產(chǎn)生下尿路癥狀和膀胱高壓等尿動(dòng)力學(xué)改變。膀胱壓力升高可導(dǎo)致膀胱、逼尿肌不穩(wěn)定或失代償狀態(tài)，形成尿潴留甚至導(dǎo)致腎積水等繼發(fā)病癥[4-5]。BPH為老年性疾病，年老體弱或房勞傷腎，腎氣不足，命門火衰，致使膀胱氣化無(wú)權(quán)?，F(xiàn)代人飲食不節(jié)易傷脾胃，后天脾胃運(yùn)化水濕能力減弱；小腸失養(yǎng)則分清泌濁功能不足，濁液不能下輸尿道；肝主疏泄，疏泄不及則水液不出。肝脾腎調(diào)節(jié)功能下降與小腸分清泌濁功能不足是造成BPH的重要原因。

根據(jù)BPH的中醫(yī)病因病機(jī)，靳三針通過傳統(tǒng)針灸理論選取中極、關(guān)元、三陰交組成尿三針。中極為膀胱募穴，可調(diào)節(jié)膀胱氣化功能；關(guān)元為小腸募穴、足三陰經(jīng)與任脈的交會(huì)穴，可調(diào)理小腸分清泌濁功能；中極、關(guān)元合用可調(diào)節(jié)尿液的生成、儲(chǔ)存與排泄。人體水液代謝的調(diào)節(jié)離不開肝脾腎的功能正常，故選取足三陰經(jīng)交會(huì)的三陰交。三穴合用共同主持水液代謝的調(diào)節(jié)，促進(jìn)膀胱氣化排出尿液，三穴合用體現(xiàn)了傳統(tǒng)針灸大道至簡(jiǎn)的特點(diǎn)。臨床上運(yùn)用尿三針為主治療老年性夜尿、尿潴留、尿失禁等各種泌尿系統(tǒng)疾病具有良好的療效[6-8]。

成功建立模型是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。此前BPH模型的制備大多采用去勢(shì)皮下注射丙酸睪酮的方法，此方法去除大鼠睪丸，打破了大鼠體內(nèi)雌/雄激素水平的生理性平衡，雄性激素分泌減少，雌激素占據(jù)主導(dǎo)。研究表明[9]，雌激素相對(duì)性增高可導(dǎo)致代謝相關(guān)性的前列腺增生。本實(shí)驗(yàn)采用不去勢(shì)皮下注射丙酸睪酮的方法建立動(dòng)物模型，更有利于研究BPH的針刺治療效果[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中模型組的前列腺濕重與前列腺指數(shù)均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。

成功建立的模型可見明顯的前列腺間質(zhì)和腺細(xì)胞增生[11]。研究證明[12]，前列腺增生與腺體內(nèi)的細(xì)胞增生和凋亡相關(guān)，尤其是與細(xì)胞凋亡減少關(guān)系更加密切。“細(xì)胞凋亡”的概念是Kerr等于1972年首次提出[13]。細(xì)胞凋亡是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種必要機(jī)制，是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡，又稱細(xì)胞程序性死亡。

本實(shí)驗(yàn)中，尿三針組的前列腺濕重與前列腺指數(shù)均低于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尿三針組的細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明尿三針能促進(jìn)BPH模型大鼠的前列腺細(xì)胞凋亡，改善其增生情況。模型組的細(xì)胞凋亡率與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在沒有尿三針干預(yù)時(shí)，BPH模型大鼠的前列腺細(xì)胞凋亡率與正常組相同，說明尿三針組的細(xì)胞凋亡并非是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是在針刺干預(yù)下機(jī)體為更好地適應(yīng)環(huán)境主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。HE染色觀察前列腺組織形態(tài)的結(jié)果中，尿三針組組織形態(tài)較模型組明顯改善，且接近正常組的前列腺組織形態(tài)，說明針刺尿三針能明顯改善BPH模型大鼠前列腺組織的形態(tài)改變，減少纖維組織增生，促進(jìn)腺細(xì)胞酸性分泌物的釋放，具有修復(fù)前列腺功能的作用。

細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體器官正常形態(tài)結(jié)構(gòu)方面起十分重要的作用，在BPH的研究中是一個(gè)重要的研究方向。在成年后前列腺細(xì)胞的凋亡與增殖建立一個(gè)新的平衡，前列腺的體積大小維持在一定的值。50歲后由于細(xì)胞凋亡異常而導(dǎo)致前列腺體積開始增長(zhǎng)[14]。Quiles[15]等研究指出，即使前列腺的體積增加了4倍，但其相比于對(duì)照組DNA的合成率仍然下降了約1/3，推測(cè)細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致BPH的可能性更高。已有研究表明，多種治療BPH的藥物可促進(jìn)前列腺細(xì)胞的凋亡。潘恩山[16]的研究表明，益腎通膠囊能降低機(jī)體內(nèi)Ki-67、Bcl-2/Bax、CD34表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；楊雪梅[17]等認(rèn)為，阿克替苷能顯著抑制前列腺增生，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Bcl -2和Bax的表達(dá)，從而促進(jìn)良性前列腺增生的細(xì)胞凋亡；朱帥[18]等研究認(rèn)為，癃暢顆?？梢韵抡{(diào)大鼠前列腺增生組織中Survivin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡減少是BPH發(fā)生的重要原因，如何促進(jìn)前列腺細(xì)胞凋亡是治療BPH的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)說明，尿三針治療前列腺增生的機(jī)理之一是促進(jìn)前列腺細(xì)胞凋亡，從而使前列腺體積縮小、質(zhì)量減輕，減輕前列腺炎癥及纖維化，從而起到治療作用。但尿三針促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍需在下一步的實(shí)驗(yàn)研究中從分子及基因水平驗(yàn)證。