劉 璐 ，曹世杰 ，程麗娜 ，邱 峰 ，3，康 寧

（1.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院生物化學教研室，天津 300193；2.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學中藥學院中藥化學教研室，天津 300193）

肥胖和2型糖尿病均與胰島素抵抗關系密切[1]。在糖尿病的發(fā)展中，脂肪組織發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，炎癥因子與脂肪組織內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)相互作用，引起胰島素抵抗，最終導致2型糖尿病發(fā)生[2]。研究表明，促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可導致脂肪組織或系統(tǒng)性炎癥的產(chǎn)生，最終可能引起胰島素抵抗[3-4]，可用于建立體外胰島素抵抗模型。然而，縱觀已發(fā)表的有關TNF-α誘導的胰島素抵抗造模文獻[5-8]，有關TNF-α劑量及作用時間對造模結果的影響以及模型建成的評價指標尚不完全清楚。

據(jù)報道，在胰島素刺激下，脂肪細胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）會從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細胞膜上，而在2型糖尿病中這種轉(zhuǎn)位功能會減弱[9]，因此，本研究采用TNF-α體外誘導法建立3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型，考察TNF-α造模用藥劑量及作用時間，并以GLUT4蛋白表達結合膜轉(zhuǎn)位的變化作為胰島素抵抗模型是否建立的指標。

1 材料

1.1 細胞 小鼠前脂肪細胞3T3-L1購于北京醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶（BIOSHARP）；胎牛血清（TBD）；胰島素（丹麥諾和諾德公司）；地塞米松（Sigma）；1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（Sigma）；羅格列酮（Sigma）；TNF-α（Pepro Tech）；葡萄糖檢測試劑盒（北京普利萊公司）；BCA試劑盒（Solarbio）；抗體：GLUT4（SAB），辣根過氧化酶標記的二抗（中杉金橋公司）。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申有限公司）；酶聯(lián)免疫分析儀（美國BioTek）；倒置顯微鏡（Nikon）；Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（Perkin Elmer）。

2 方法

2.1 3T3-L1前脂肪細胞的培養(yǎng)和誘導分化 當3T3-L1前脂肪細胞貼壁生長至鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時，使細胞接觸抑制48 h，然后進行誘導分化，將細胞培養(yǎng)液換成含有0.5 mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μmol/L的地塞米松、10μg/mL的胰島素、3μmol/L的羅格列酮和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。孵育48h后將培養(yǎng)液換成含有10μg/mL的Insulin、3μmol/L的羅格列酮和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基再孵育48 h后換液，換成含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，每48 h換液1次，直至80%以上的細胞分化成熟。

2.2 油紅O染色法鑒定脂肪細胞 將誘導分化成熟的脂肪細胞用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次，然后用10%的甲醛溶液室溫固定1 h，移去固定液后用PBS洗3次，晾干細胞。加入3 mg/mL用異丙醇溶解的油紅O染液，室溫染色10 min，然后用水洗至少3次，每次5 mL，洗去殘渣和細胞縫隙中的染料，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 TNF－α誘導脂肪細胞胰島素抵抗 取誘導分化成熟的3T3－L1脂肪細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，設立4個組，分別是：空白對照組、空白對照加胰島素組、模型組和模型加胰島素組。細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換為含有0．5%牛血清白蛋白的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育8 h，然后將空白對照組的培養(yǎng)液換為含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，模型組換為加入5、10、15、20、25 ng/mL TNF－α并含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別作用48、72、96 h，期間空白對照組和模型組的培養(yǎng)基每24 h更換1次。最后，棄去原有培養(yǎng)基，用PBS洗1次，將空白對照組和模型組換為無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，空白對照加胰島素組和模型加胰島素組換為加入含有100 nmol/L胰島素的無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，30 min后吸取上清液，用葡萄糖氧化酶法試劑盒檢測上清液中葡萄糖含量。

2.4 TNF－α對3T3－L1脂肪細胞的毒性 取已建立好胰島素抵抗模型的3T3－L1脂肪細胞，吸棄上清液后，PBS清洗1次，然后每孔加入100μL 5 mg/mL的MTT溶液，在 5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育 2．5 h后，加入150μL二甲基亞砜溶解，震蕩10 min，于490 nm處測定吸光值。

2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測GLUT4蛋白在膜上的表達情況 細胞造模結束后，空白對照加胰島素組和模型加胰島素組分別加100 nmol/L的胰島素刺激30 min，去除培養(yǎng)液，收取細胞于1．5 mL的離心管中，按照膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。依據(jù)蛋白濃度取10μg總蛋白質(zhì)，以10%的SDS－PAGE膠分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)法（100 V，3 h）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的TBST（含0．1%Tween20）室溫下封閉2 h后加入GLUT4的一抗，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫2 h，充分洗滌后用ECL顯影曝光，洗片后用激光掃描儀掃描，使用Image J軟件進行灰度分析，目的蛋白的相對含量為樣品組灰度/對照組灰度的值。

2.6 高內(nèi)涵技術檢測GLUT4的膜轉(zhuǎn)位 取誘導分化好的3T3－L1脂肪細胞，以1×104細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)黑板中，TNF－α按照10 ng/mL作用96 h，同時設置空白對照。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，5%胎牛血清封閉2 h，加入一抗孵育過夜。PBS洗3次，加入Dylight 550標記的二抗工作液，37℃孵育1 h，含0．05%Tween20的PBS洗3次，再用PBS洗3次，加入Hoechst 33342孵育15 min，PBS洗滌細胞3次后，用Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)進行檢測，再通過Perkin Elmer公司提供的Columbus對視野中細胞熒光強度分布結構等信息進行量化統(tǒng)計。

2.7 統(tǒng)計學分析 所有實驗獨立重復操作至少3次，實驗結果表示為均數(shù)±標準差（x±s）。實驗結果采用SPSS 21．0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析。P＜0．05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 脂肪細胞形態(tài)學變化 油紅O作為脂肪特異性染色劑，能與中性脂肪結合使成熟脂肪細胞中的脂滴著色，從而觀察脂肪細胞中脂肪的含量。從油紅O染色的結果可看出80%以上的細胞出現(xiàn)較大脂滴，呈現(xiàn)脂肪細胞表型，證明本研究采用的誘導分化方法切實可行。見圖1。

圖1 3T3-L1脂肪細胞油紅O染色圖(×200)Fig.1 Oil red O stained 3T3-L1 adipocytes(×200)

3.2 TNF－α作用時間和濃度變化對3T3－L1前脂肪細胞存活率及葡萄糖消耗的影響 5、10、15、20、25 ng/mL的TNF－α分別作用于3T3－L1脂肪細胞48、72、96 h 后，采用噻唑藍（MTT）法測定細胞的存活率。5、10、15、20 和 25 ng/mL 的 TNF－α 作用 48、72 h及5、10 ng/mL作用96 h時細胞存活率均大于80%。進一步，選擇存活率大于80%的劑量和時間，再用100 nmol/L的胰島素刺激細胞30 min，采用葡萄糖氧化酶法試劑盒檢測其對細胞葡萄糖消耗量，見表1。與未加胰島素的正常對照組相比，胰島素刺激能夠顯著增加細胞對葡萄糖的消耗。然而與加胰島素的正常對照組相比，胰島素刺激TNF－α作用96 h組細胞葡萄糖消耗顯著降低，并且呈劑量依賴。加胰島素與未加胰島素的TNF－α模型組間葡萄糖消耗沒有顯著差異，以上結果表明，10 ng/mL TNF－α誘導3T3－L1細胞96 h產(chǎn)生明顯的胰島素抵抗。見表2。

表1 3T3-L1脂肪細胞的存活率（x±s）Tab.1 Survival rate of 3T3-L1 adipocytes（x±s）%

表2 3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖消耗（x±s）Tab.2 Effect of TNF-αon glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes（x±s）mmol/L

3.3 TNF－α對3T3－L1脂肪細胞膜上GLUT4蛋白表達的影響 研究表明，GLUT4參與脂肪細胞對葡萄糖攝取，其可能是胰島素抵抗的重要分子機制[9]。利用Western blot考察TNF－α誘導的3T3－L1脂肪細胞胰島素抵抗模型中細胞膜GLUT4的表達。由圖2可以看出，以Caveolin為內(nèi)參，無胰島素刺激時，與未造模組相比，加TNF－α組細胞膜上GLUT4顯著降低；在胰島素的刺激下，TNF－α組與只加胰島素組細胞膜GLUT4的表達有顯著減少，只加胰島素組與空白對照組相比細胞膜GLUT4有明顯的增加，蛋白定量結果與Western blot結果一致，見表3?？梢?，GLUT4膜蛋白表達下調(diào)與胰島素抵抗模型建立相關。

圖2 TNF-α對3T3-L1脂肪細胞膜上GLUT4表達的影響Fig.2 Effectsof TNF-αon GLUT4 expression in 3T3-L1 adipocyte membrane

表3 3T3-L1脂肪細胞膜上GLUT4的蛋白定量（x±s）Tab.3 Protein quantification of GLUT4 on 3T3-L1 adipocyte membrane（x±s）

3.4 高內(nèi)涵分析GLUT4的膜轉(zhuǎn)位 為了進一步檢測TNF－α引起的胰島素抵抗是否導致GLUT4從胞漿轉(zhuǎn)位至細胞膜，利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)考察了GLUT4在細胞中的分布情況，并進行定量分析。結果如圖3所示，空白對照組C中，GLUT4蛋白均勻分布在胞漿（黃色熒光），給予胰島素（100 nmol/L）作用15 min后，GLUT4一部分轉(zhuǎn)移到膜上（C+I）。模型組（M）細胞膜上GLUT4的表達較空白對照組（C）顯著減少，模型加胰島素組（M+I）與空白對照加胰島素組（C+I）相比，模型加胰島素組（M+I）的 GLUT4在膜上的表達量相對較少，與定量分析結果一致，見表4，由此可以看出TNF－α誘導的胰島素抵抗可以減少GLUT4的膜轉(zhuǎn)位。

4 討論

糖尿病是一種進行性發(fā)展的慢性、終身性疾病。近年來，隨著人民生活水平的提高，糖尿病的患病率逐年上升。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)，2015年全球糖尿病的患病率為8．8%，患病人數(shù)達4．15億，死亡人數(shù)達到500萬，糖尿病已成為嚴重影響人類健康的主要慢性非傳染性疾病之一[10]。現(xiàn)代醫(yī)學認為其發(fā)病主要與遺傳、環(huán)境因素等相關，胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病、發(fā)展過程中起到至關重要的作用。

圖3 TNF-α誘導的胰島素抵抗對GLUT4的膜轉(zhuǎn)位的影響（×200）Fig.3 Effect of TNF-α-induced insulin resistanceon translocation of GLUT4 to theplasma membrane(×200)

表4 3T3-L1脂肪細胞膜上GLUT4蛋白的平均光密度值（x±s）Tab.4 Mean optical density of GLUT4 protein on 3T3-L1 adipocyte membrane（x±s）

胰島素抵抗既是2型糖尿病的特征又是導致2型糖尿病的主要原因[11]。遺傳因素、胰島素信號通路障礙、血清游離脂肪酸濃度增高或細胞內(nèi)脂肪含量增多、炎癥和氧化應激等諸多因素均可引起胰島素抵抗[12]。

王春等[13]考察了111例2型糖尿病住院患者空腹血清TNF－α的水平后認為糖尿病患者體內(nèi)的TNF－α與胰島素抵抗輕重程度呈正相關，進一步說明TNF－α在胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，并且肥胖是影響炎癥因子水平與胰島素抵抗的重要因素。其中，TNF－α主要由脂肪組織分泌產(chǎn)生，與慢性胰島素抵抗的發(fā)生關系密切。TNF－α可通過多途徑影響胰島素信號傳導通路來參與胰島素抵抗的發(fā)生[14]。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，對TNF－α基因進行剔除后，能夠增加體內(nèi)胰島素敏感性，從而改善糖脂代謝，間接說明TNF－α可能引起胰島素抵抗[15]。

據(jù)此，本研究采用TNF－α作用于3T3－L1脂肪細胞，從慢性低度的炎癥角度出發(fā)建立胰島素抵抗模型。Li等[16]與 Palaci－Osortega 等[17]采用了 10 ng/mL的TNF－α分別持續(xù)刺激分化成熟的3T3－L1脂肪細胞24 h和48 h建立胰島素抵抗模型；還有一些研究人員[18]采用2 ng/mL的TNF－α孵育96 h建立3T3－L1脂肪細胞胰島素抵抗模型。相反，有研究[19]表明，在TNF－α作用時間相對較短（24 h）時，脂肪細胞的胰島素依賴性信號轉(zhuǎn)導不受影響，胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運無顯著變化，據(jù)此，本研究中造模作用時間分別是48、72、96 h，發(fā)現(xiàn)不同的作用時間下高劑量的TNF－α均會使細胞存活率顯著降低；而TNF－α使用劑量過低均不能引起胰島素依賴性葡萄糖攝取的變化，也因此不能引起胰島素抵抗。同時，TNF－α作用超過96 h后也不會引起胰島素敏感性葡萄糖攝取下降。研究結果表明TNF－α誘發(fā)3T3－L1細胞胰島素抵抗模型的最佳方案為10ng/mL的TNF－α作用細胞96 h。鑒于上述文獻只是用葡萄糖攝取的方法檢測模型是否成立，并沒有考察TNF－α對細胞存活率的影響，胰島素抵抗模型在考察了造模藥TNF－α的作用時間及使用劑量的同時，考察TNF－α對細胞存活率的影響，以保證TNF－α的劑量不影響細胞活力，從而造成重現(xiàn)性好的胰島素抵抗模型。

有文獻報導，TNF－α與其他細胞因子在脂肪組織中直接或間接地影響著體內(nèi)葡萄糖代謝，TNF－α可直接抑制脂肪細胞中主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT4，使其表達下降而降低胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運，誘發(fā)胰島素抵抗[20]。而且，胰島素抵抗的肥胖病人脂肪細胞中GLUT4表達水平明顯下降。此外，TNF－α刺激下，GLUT4在2型糖尿病大鼠脂肪和肌肉細胞中的表達明顯降低[21]。另一方面研究發(fā)現(xiàn)，Ishibashi等[22]通過elaidate誘導的3T3－L1脂肪細胞胰島素抵抗模型中，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜上的GLUT4明顯下降，從而引起葡萄糖的消耗減少。這與以往Prasad等[23]的研究結果一致。Zierath等[24]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞長期暴露于高濃度胰島素誘導的胰島素抵抗模型中GLUT4活性降低或轉(zhuǎn)位障礙，且對生理濃度的胰島素刺激無反應。近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗細胞模型中細胞膜上GLUT4蛋白表達量均會顯著減少[23-28]，GLUT4介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運是外周組織葡萄糖利用的限速步驟[29]。因此，推測GLUT4膜蛋白表達及膜轉(zhuǎn)位可以作為判定TNF-α胰島素模型是否建立的標準。本研究中對3個批次細胞樣品進行分析，TNF-α刺激的3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型中有或無胰島素刺激時，GLUT4在細胞膜上的表達均明顯下降，說明GLUT4的下調(diào)作用可能與胰島素抵抗相關。與此同時實驗中采用了高內(nèi)涵篩選的方法定性定量地進行GLUT4膜轉(zhuǎn)位檢測。

高內(nèi)涵篩選分析作為系統(tǒng)生物學時代的一項領先技術，能夠快速高效獲得細胞所產(chǎn)生的實時和多維立體的生物效應信息[30]。在保持細胞結構和功能完整性的前提下，高內(nèi)涵篩選設備具有的高分辨率熒光數(shù)碼成像系統(tǒng)可以通過多維立體的方式進行實時監(jiān)控某待測樣品對細胞產(chǎn)生的效應信號，可以在實驗中同步檢測被篩樣品對于細胞生理狀態(tài)（如細胞形態(tài)、生長分化狀態(tài)、信號通路以及細胞代謝途徑的各個環(huán)節(jié)）的改變[31]，并且可以從多角度觀察被篩樣品對細胞內(nèi)蛋白表達及轉(zhuǎn)移的影響[32]。穆蕊等[33]應用HCS平臺對TNF-α刺激前后的核因子-κB（NF-κB）的熒光信號進行量化,通過計算細胞核/細胞漿熒光強度的比值來表示NF-κB的細胞定位。本實驗通過高內(nèi)涵篩選探究了胰島素抵抗模型細胞中GLUT4分布，結果顯示TNF-α誘導的胰島素抵抗可以明顯減少GLUT4的膜轉(zhuǎn)位，在證明胰島素抵抗模型成立的同時，也可以更加形象直觀地觀察到GLUT4蛋白的分布變化情況。既然脂肪細胞中GLUT4與胰島素抵抗直接相關，那么通過高內(nèi)涵定量分析的方法考察GLUT4的膜轉(zhuǎn)位就有可能為驗證脂肪細胞胰島素抵抗提供借鑒。幾次造模結果均顯示TNF-α誘導的胰島素抵抗模型中GLUT4膜蛋白表達顯著減少，與葡萄糖攝取結果保持一致。鑒于胰島素抵抗模型成立的鑒定方法多采用檢測葡萄糖消耗量這一種形式[16-18]，因而本實驗建立起來的GLUT4膜蛋白表達及膜轉(zhuǎn)位測定可以作為鑒定模型是否成功及是否穩(wěn)定的指標。

綜上所述，本研究運用TNF-α孵育3T3-L1細胞建立胰島素抵抗模型，并且建立起模型鑒定的新指標，可進一步用于研究炎癥引起的胰島素抵抗機制及篩選具有抗糖尿病活性的藥物。