次 仁 許 芳 高 萬(wàn) 吉騰飛*

(1. 西藏藏醫(yī)學(xué)院,西藏 拉薩 850000；2. 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

藏藥小檗皮為小檗科植物小檗(Berberis kansuensis Schneid.)莖或根的內(nèi)皮，具有清熱解毒、燥濕之功，用于治療痢疾、尿路感染、腎炎及瘡癤、結(jié)膜炎等疾病。作為藏醫(yī)常用藥材，藏成藥小檗眼膏、八味小檗皮丸、四味姜黃湯散中均含有此藥。小檗屬植物中含有季胺型生物堿小檗堿(berberine)、巴馬汀(palmatine)，文獻(xiàn)報(bào)道的分析方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)等[1-9]。在現(xiàn)行版藏藥標(biāo)準(zhǔn)中，僅對(duì)該藥材的性狀、鑒別等生藥特性進(jìn)行描述，暫無(wú)化學(xué)成分的測(cè)定。查閱文獻(xiàn)資料，目前僅測(cè)定小檗皮中小檗堿的含量[10]，而巴馬汀的含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。為此，課題組擬建立HPLC法測(cè)定藏藥小檗皮中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量，為健全藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、有效控制藏藥質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司，DAD檢測(cè)器)，電子天平(日本AND公司，HA-202M)。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-200609)；鹽酸巴馬汀對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0732-200005)；小檗皮經(jīng)西藏藏醫(yī)學(xué)院次仁博士提供并鑒定為小檗科植物甘肅小檗的干燥莖皮。乙腈為色譜純(Merck公司)，甲醇為色譜純(Merck公司)，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為 Aglient XDB C18(4.6mm×50mm，5μm)，流動(dòng)相為水-乙腈-乙酸-三乙胺(70:30:0.5:0.745)等度洗脫，體積流量1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)345nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量10μL。

數(shù)據(jù)處理：峰面積外標(biāo)法定量。在此色譜條件下，對(duì)照品鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀峰形對(duì)稱，小檗皮供試品的色譜中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀能與其它成分很好分離。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀各2.000mg，分別置10mL 量瓶中，加甲醇溶解定容至10mL，制成0.2mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取小檗皮樣品粉末0.1g左右，精密稱定，加1%鹽酸甲醇100mL，超聲提取30min，蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，定容，用0.45μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取 2.2 項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，制成濃度為40.0、80.0、120.0、160.0、200.0μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液和濃度為1.60、3.20、4.80、6.40、8.00μg/mL的鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為橫坐標(biāo)對(duì)鹽酸小檗堿對(duì)照品(μg) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y = 920.88X-25.221，r2=0.9999，線性范圍為0.400～2.000μg。以峰面積為橫坐標(biāo)對(duì)鹽酸巴馬汀對(duì)照品(μg) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=31.445X-4.665，r2=0.9999，線性范圍為0.016～0.800μg，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 鹽酸小檗堿的線性關(guān)系

表2 鹽酸巴馬汀的線性關(guān)系

2.5 精密度考察 精密吸取對(duì)照品溶液 10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。測(cè)得鹽酸小檗堿的RSD為0.19%，鹽酸巴馬汀的RSD為0.082%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，16h進(jìn)樣測(cè)定，鹽酸小檗堿的RSD為0.69%，鹽酸巴馬汀的RSD為0.82%。表明該供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性考察 精密稱取同一樣品粉末6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，鹽酸小檗堿的RSD為0.07%；鹽酸巴馬汀的RSD為0.003%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀含量的小檗皮樣品粉末0.05g，共5 份，加入對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。鹽酸小檗堿的加樣回收率98.5%，RSD=1.49%；鹽酸巴馬汀的加樣回收率為97.5%，RSD=1.23%，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 鹽酸小檗堿的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 鹽酸巴馬汀的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 鹽酸巴馬汀的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 提取條件的選擇 分別采用甲醇、乙醇、50%乙醇、50%甲醇和1%鹽酸甲醇等不同溶劑超聲，比較超聲提取及加熱回流提取的效果，1%鹽酸甲醇超聲提取結(jié)果最好，故選擇其為提取溶劑。

對(duì)不同提取時(shí)間進(jìn)行了考察，以1%鹽酸甲醇為提取溶劑分別超聲提取 10、20、30、45、60 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 30 min 與 45 min 的提取效果基本一致，故選擇超聲提取 30 min。

4.2 色譜條件的選擇 由于檢測(cè)僅2種化學(xué)成分，且2者均為檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選用等度洗脫。因2種成分的最大吸收波長(zhǎng)均為345 nm，故以345 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

4.3 流動(dòng)相的選擇 選擇甲醇-水系統(tǒng)時(shí)，分離不好；選擇甲醇- 0.1 % 磷酸系統(tǒng)的分離效果好，且與樣品其他成分分離較好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

5 結(jié)論

本研究采用HPLC法建立了藏藥小檗皮中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的測(cè)定分析方法。該藥材中鹽酸小檗堿的含量約為鹽酸巴馬汀的20倍，可明確鹽酸小檗堿是其活性成分之一。同時(shí)，該方法可以同時(shí)測(cè)定小檗皮中2種不同化學(xué)成分，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為藏藥小檗皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。