楊 洋 李 珍 丁 華 郭 慧 張 燁

(內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

其格日木湯由五靈脂、紅花、丹參、北五味子、甘草、梔子、川木通、瞿麥、柯子、川楝子、苦地丁、黃連、豬膽粉等13味藥組成[1]，本文主要測定方中紅花的含量。紅花化學(xué)成分比較復(fù)雜，富含黃色素與紅色素，所含的脂肪油俗稱為紅花油[2]。從紅花中分離確定的化學(xué)成分主要有含黃酮類物質(zhì)、脂肪酸、色素、酚酸、揮發(fā)油等多種活性成分[3]，其中起活血化淤作用的主要有效成分是紅花黃色素，屬于醌式查爾酮類化合物，是紅花發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。Meselhy MR 等[4]于1993 年從紅花中分離得到的羥基紅花黃色素 A ( hydroxysafflor yellow A，HSYA) ，是紅花黃色素中含量較高的成分，其含量的多少對紅花的藥效有著直接影響[5]。中國藥典一部從2005年版[6]開始收錄并規(guī)定以 HYSA為紅花中的代表性活性成分進(jìn)行含量測定。在蒙藥制劑其格日木湯含量測定的標(biāo)準(zhǔn)研究過程中，方中紅花以HYSA作為測定指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定含量。通過試驗(yàn)摸索，確定了較為理想的色譜條件，經(jīng)過方法學(xué)考察及陰性對照實(shí)驗(yàn)，表明該方法簡便，重現(xiàn)性好，專屬性較強(qiáng)，且方中其他組分對HYSA的測定無干擾，為蒙藥制劑其格日木湯中紅花成分的定量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀，PDA檢測器；島津UV-1700型紫外分光光度計(jì)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器。

羥基紅花黃色素A對照品(批號：111637-201308；中國食品藥品檢定研究院)；其格日木湯由本中心蒙研所提供。甲醇、乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用Kromasil C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.7%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0±0.1)-甲醇-乙腈為流動相，流速1.0 mL·min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。羥基紅花黃色素A峰的理論塔板數(shù)均大于3000，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品儲備液 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品1.94 mg，置25 mL容量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL溶液中含羥基紅花黃色素A 0.786 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取其格日木湯樣品約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取按處方比例并以相同工藝制備的缺少紅花的陰性對照，按與供試品溶液相同的方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察 采陰性對照試驗(yàn)。在同一色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各10 μL，測定液相色譜圖，結(jié)果陰性對照溶液的色譜圖中在與羥基紅花黃色素A對照品以及供試品色譜圖相對應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對羥基紅花黃色素A的測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品儲備液0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置5 mL量瓶中，用25%甲醇定容至刻度，搖勻，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸處理得羥基紅花黃色素A回歸方程為y=11493x+3211.2 r=0.9996，線性范圍為0.776～7.760μg。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述其格日木湯供試品溶液，分別于0、2、4、8、24、32 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A峰面積的RSD為1.23%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表1 不同時(shí)間測定樣品中羥基紅花黃色素A的峰面積

2.6 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄羥基紅花黃色素A峰面積，計(jì)算RSD(n=6)為1.6%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批其格日木湯6份，每份約1.5 g，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，并計(jì)算含量。羥基紅花黃色素A的平均含量為1.0596 mg·g-1，RSD為0.90%。表明該方法重復(fù)性良好。

表2 羥基紅花黃色素A含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已測定含量的其格日木湯樣品6份(平均含量為1.0596 mg/g)，每份約0.75 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各精密加入羥基紅花黃色素A對照品儲備液 1 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備供試溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算羥基紅花黃色素A的量，計(jì)算回收率。結(jié)果羥基紅花黃色素A平均回收率(n=6)為100.9%，RSD=1.41%。表明該方法回收率良好。

表3 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 樣品含量測定

取3批蒙藥制劑其格日木湯，分別按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄羥基紅花黃色素A峰面積，采用外標(biāo)峰面積計(jì)算含量。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg·g-1)

4 討論

4.1 提取條件的選擇 羥基紅花黃色素A為黃酮類成分，選用25%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲溶解提取，比較超聲15、30、45和60 min等不同提取時(shí)間對提取效率的影響，并測定含量，結(jié)果顯示超聲45 min后供試品溶液中羥基紅花黃色素A的含量基本穩(wěn)定不變，故將提取時(shí)間定為超聲處理45 min。

4.2 流動相的選擇 以0.7%磷酸溶液-甲醇-乙腈為流動相為流動相，進(jìn)行流動相條件摸索，當(dāng)流動相比例為76:26:2時(shí)，樣品中的雜質(zhì)峰分離度小于1.5，調(diào)節(jié)流動相比例至79:19:2，羥基紅花黃色素A峰與其它成分的分離度大于1.5，但是對照品羥基紅花黃色素A峰型不對稱，加三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0時(shí)，峰型對稱，故將流動相確定為0.7%磷酸溶液(三乙胺調(diào)pH值至6.0±0.1)-甲醇-乙腈。

4.3 檢測波長的選擇 取羥基紅花黃色素A對照品溶液，于紫外可見光分光光度儀，自200 nm～700 nm做光譜掃描，羥基紅花黃色素A在波長403 nm與224 nm處有最大吸收。選擇不同波長考察并且對比后發(fā)現(xiàn)，對于羥基紅花黃色素A在224 nm下的出峰面積無法達(dá)到定量要求，為了保證定量準(zhǔn)確，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6]選用403 nm作為檢測波長，方法學(xué)考察表明在該波長下結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

5 結(jié)論

通過本文的研究考察，對3批蒙藥制劑其格日木湯中紅花的含量進(jìn)行了測定，考慮到不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)對紅花的影響以及制藥過程中的損耗，并結(jié)合檢測樣品的實(shí)際羥基紅花黃色素A含量，確定每1 g其格日木湯制劑含紅花以羥基紅花黃色素A(C27H30O15)計(jì)，不得少于0.50 mg。