吳海波，江連洲

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CaCl2和pH值對(duì)水酶法提取大豆油形成乳狀液破乳效果影響

吳海波1，江連洲2※

（1. 欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，欽州 535011；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

為探明粗酶水相提取大豆油所產(chǎn)乳狀液的破乳機(jī)制，通過破乳率、Zeta電位、黏度、粒徑分布和平均粒徑指標(biāo)分別考察無機(jī)鹽和pH值對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響。為了比較無機(jī)鹽的破乳效果，該文在乳狀液中分別添加濃度均為0.06 mol/L的CaSO4、CaCl2、MgCl2、NaCl，80 ℃條件下反應(yīng)10 min，結(jié)果顯示4種無機(jī)鹽均可顯著降低乳狀液穩(wěn)定性，其中CaCl2破乳率最高，然后依次為CaSO4、MgCl2、NaCl。盡管CaCl2在60、70、80 ℃時(shí)均可實(shí)現(xiàn)徹底破乳，但破乳率隨CaCl2濃度（0.02～0.08 mol/L）、反應(yīng)時(shí)間（0～90 min）、反應(yīng)溫度（60～80 ℃）的增加而提升。CaCl2實(shí)現(xiàn)徹底破乳后，破乳率隨反應(yīng)時(shí)間延長而下降。添加CaCl2后乳狀液的電位絕對(duì)值和黏度降低，油滴發(fā)生聚合，平均粒徑增加，使乳狀液穩(wěn)定性下降。CaCl2濃度和反應(yīng)溫度的提升均可導(dǎo)致電位絕對(duì)值和黏度下降程度增強(qiáng)，破乳率進(jìn)一步上升。在50 ℃、pH為值3～9時(shí)，降低pH值可使乳狀液電位絕對(duì)值和黏度顯著下降，導(dǎo)致油滴平均粒徑增加，乳狀液穩(wěn)定性下降。pH值為3～4時(shí)乳狀液的電位絕對(duì)值最低，接近0，此時(shí)乳狀液穩(wěn)定性最低，破乳率最高。但當(dāng)pH值小于3時(shí)，乳狀液電位絕對(duì)值和黏度再次升高，致使油滴平均粒徑和破乳率降低。光鏡照片顯示破乳后乳狀液中油珠直徑明顯增大。該研究可為水酶法提取大豆油破乳技術(shù)提供理論依據(jù)。

水解；乳狀液；穩(wěn)定性；水酶法；破乳

0 引 言

水相酶法提油工藝是一項(xiàng)以水為提取介質(zhì)，利用酶解破壞植物油料細(xì)胞壁或脂蛋白從而將油釋放出來的生物制油技術(shù)，具有環(huán)境污染小、操作安全、無溶劑殘留、油和蛋白同時(shí)獲得等優(yōu)點(diǎn)[1-4]，被廣泛應(yīng)用于大豆[5]、花生[6]、葵花籽[7], 菜籽[8]、玉米[9]等作物提油工藝中。在水酶法大豆油提取過程中，伴隨豆粉的水解，油和蛋白同時(shí)解離[10-11]，由于蛋白具有良好的乳化性能[12]，可迅速吸附于油水之間，形成界面膜包裹在油滴外部，從而形成由多個(gè)油滴組成的O/W乳化體系[4]。因此水酶法提取大豆油工藝直接得到的游離油非常有限，僅占總油提取率的10%～25%，而大部分（約75%～90%）油都存在于水油界面之間的乳化層中[12-13]，因此若要提高水酶法工藝的經(jīng)濟(jì)效益、實(shí)現(xiàn)水酶法制油技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，必須采取適當(dāng)?shù)钠迫榉椒ɑ厥杖闋钜褐械挠汀?/p>

多項(xiàng)研究表明蛋白和磷脂是乳狀液中主要的乳化物質(zhì)[14]，特別是蛋白，是維持乳狀液穩(wěn)定的主要貢獻(xiàn)者[12-16]。因此許多學(xué)者利用破壞蛋白乳化性能進(jìn)行破乳，例如Zhang等[17-19]利用蛋白酶水解乳狀液的生物酶法破乳，Li等[20]使用乙醇、Chabrand[21]采用冷凍解凍方式使蛋白變性，達(dá)到破乳目的。但這些研究有的增加了酶的使用，有的使用了有機(jī)溶劑，有的能耗較高，造成成本的提高和操作的復(fù)雜。

由于蛋白可以解離，因此乳狀液油-水界面通常存在著電荷和電位[22]，導(dǎo)致各油體間存在靜電排斥力，抑制了油滴聚合。無機(jī)鹽能解離出帶電離子，可與蛋白中帶相反電荷的基團(tuán)發(fā)生離子反應(yīng)，產(chǎn)生電中和效應(yīng)，減弱蛋白電荷[23-25]；適宜降低體系pH值，也可中和蛋白所帶電荷[14]，因此無機(jī)鹽和降低pH值均可導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性下降。較于上述破乳方法，無機(jī)鹽和調(diào)節(jié)pH值破乳具有成本低、操作簡單易行的顯著優(yōu)點(diǎn)。但目前無機(jī)鹽和pH值破乳研究主要集中于工藝條件的優(yōu)化[26-27]，而無機(jī)鹽和pH值變化在破乳過程中對(duì)大豆乳狀液的電位、黏度、粒徑影響的系統(tǒng)性研究較少，而這些性質(zhì)與乳狀液的穩(wěn)定性密切相關(guān)[6,15]。Yi等[28]研究證實(shí)乳狀液的電位絕對(duì)值越低，油滴間靜電排斥力越弱，乳狀液越不穩(wěn)定。劉麗婭等[29]研究酪蛋白酸鈉乳狀液時(shí)發(fā)現(xiàn)乳狀液黏度越低，油滴運(yùn)動(dòng)所受阻力越小，更易于油滴聚集。而乳狀液中油珠平均粒徑越大，乳狀液穩(wěn)定性越差[13]。本研究在先前粗酶水相制取大豆油取得較高總油提取率基礎(chǔ)上[30]，針對(duì)其過程中產(chǎn)生的乳狀液，分別考察無機(jī)鹽濃度（0.02～0.08 mol/L）、反應(yīng)溫度（60～80 ℃）和體系pH值（2～9）對(duì)乳狀液性質(zhì)（電位、黏度、油滴粒徑分布及平均粒徑）和破乳率的影響，解析破乳過程中電位、黏度、油滴平均粒徑變化與破乳率間的聯(lián)系，為2種破乳方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)原料

大豆（墾農(nóng)22號(hào)），含油率為22.3%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.7%，貯存于4 ℃冰箱中。

1.1.2 試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌ATCC 20524，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.57%低溫脫脂豆粕，1.48%葡萄糖，0.05%KH2PO4，0.5%吐溫80，pH值9，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

Master2000型激光粒度儀、ZEM 5003型Zeta電位儀，英國馬爾文公司；RS-150型流變儀，德國哈克公司； Z36HK型高速恒溫離心機(jī)，德國Hermle Labortechnik GmbH公司；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海盛磁儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及指標(biāo)測定方法

1.2.1 粗酶液的制備

按吳海波等[30]的方法進(jìn)行粗酶液的制備，主要步驟為：活化后的枯草芽孢桿菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)42 h，5 000 r/min離心20 min，所得上清液采用硫酸銨鹽析沉淀，4 ℃過夜，離心所得沉淀物裝入透析袋中，置于Tris-HCl緩沖液中透析，得到去鹽的同時(shí)含有堿性蛋白酶和中性蛋白酶的粗酶液。

1.2.2 大豆乳狀液的制備

在先前粗酶提取大豆油最佳工藝條件下進(jìn)行乳狀液的制備[30]。主要工藝如下

1）將清理去雜后的大豆進(jìn)行擠壓膨化，所得膨化物料粉碎后過100目篩備用。

2）在粗酶液中加入磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制成0.2 mol/L的緩沖酶液，調(diào)節(jié)粗酶液中的堿性蛋白酶活至（2 000±200） U/mL，中性蛋白酶活至（1 500±200） U/mL，將膨化豆粉接入酶液中，使大豆粉﹕酶液比為1∶8（質(zhì)量體積比），在55 ℃，起始pH值為10時(shí)酶解6 h，90 ℃加熱10 min滅酶，4 500 r/min離心20 min后，將乳狀液從離心管中分離出來，并置于4 ℃冰箱貯存24 h，去除沉析水分后備用。

1.2.3 不同無機(jī)鹽對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響試驗(yàn)

依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將乳狀液加熱至80 ℃，分別加入CaCl2、CaSO4、MgCl2、NaCl，使各鹽濃度均達(dá)0.06 mol/L，80 ℃攪拌（300 r/min）反應(yīng)10 min后，3 000 r/min離心15 min，測其破乳率，破乳率按公式（1）計(jì)算。

1.2.4 CaCl2對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響試驗(yàn)

將含有不同濃度CaCl2（0.02、0.04、0.06、0.08 mol/L）的乳狀液分別在60、70、80 ℃條件下攪拌（300 r/min）反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置各加熱條件下不加CaCl2的空白樣，測各樣品不同反應(yīng)時(shí)間的破乳率，離心條件為3 000 r/min離心15 min。

乳狀液中油的質(zhì)量依據(jù)GB 5009.6-2016中的堿水解法測定。

1.2.5 pH值對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響試驗(yàn)

將加熱至50 ℃的乳狀液，用2 mol/L的HCl和2 mol/L的NaOH將pH值分別調(diào)節(jié)至2、3、4、4.5、5、6、7、8、9，恒溫保持 30 min后，3 000 r/min離心15 min，測各條件下的破乳率。

1.2.6 CaCl2對(duì)乳狀液表觀黏度影響試驗(yàn)

按Jung等[31]方法并稍作修改，具體為：室溫條件下，采用流變儀在剪切速率0.01～1 000 s–1范圍內(nèi)對(duì)添加CaCl2的乳狀液進(jìn)行黏度測定，其中模具為直徑60 mm的平板，間隙為0.5 mm。

1.2.7 CaCl2對(duì)乳狀液Zeta電位影響試驗(yàn)

將添加CaCl2的乳狀液樣品用去離子水稀釋至0.01%濃度，充分混勻后，裝入測量皿，放入Zeta電位儀中測電位電勢(shì)[32]。

1.2.8 CaCl2對(duì)乳狀液油脂粒徑分布、平均粒徑（4, 3）影響試驗(yàn)

將添加CaCl2的乳狀液樣品用去離子水稀釋至11%～14%，室溫下采用激光粒徑分析儀測定粒徑分布曲線和平均粒徑（4, 3），其中油滴折光指數(shù)為1.47，驅(qū)散相折光指數(shù)1.333[32]。

1.2.9 pH值對(duì)乳狀液表觀黏度、Zeta電位、油脂粒徑分布以及平均粒徑（4, 3）影響試驗(yàn)

將pH值分別為2、3、4、4.5、5、6、7、8、9的乳狀液于50 ℃加熱30 min后，分別按1.2.6、1.2.7、1.2.8的操作方法進(jìn)行表觀黏度、Zeta電位、油脂粒徑分布以及平均粒徑（4, 3）的測定。

1.2.10 乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)

利用考馬斯亮藍(lán)對(duì)蛋白質(zhì)染色，蘇丹紅Ⅲ對(duì)脂肪球染色的原理，將蘇丹紅Ⅲ和考馬斯亮藍(lán)先后加入乳狀液中混勻染色，并置于光學(xué)顯微鏡下觀察破乳前后乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣品的均值，采用Statistix8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，判斷彼此間的差異顯著性（<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 無機(jī)鹽對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

2.1.1 不同無機(jī)鹽的破乳效果

圖1為不同無機(jī)鹽對(duì)乳狀液破乳率的影響。由圖1可知, 所有樣品中，未加鹽的樣品破乳率最低，而加鹽的乳狀液破乳率顯著增加，說明無機(jī)鹽可降低乳狀液的穩(wěn)定性。其中CaCl2破乳率最高，然后依次是CaSO4、MgCl2、NaCl。乳狀液中油滴外部被以蛋白為主要成分的界面膜所包裹[14-16]，由于蛋白可以解離，因此各油體帶有電荷，彼此間存在的靜電排斥力使乳狀液保持一定的穩(wěn)定性[14, 22]。Arakawa等[33-34]研究證實(shí)各鹽與蛋白結(jié)合能力的強(qiáng)弱排序?yàn)镃a2+>Mg2+>Na+。Na+與水的結(jié)合能力強(qiáng)于與蛋白的結(jié)合能力，Ca2+和Mg2+等二價(jià)陽離子更易與蛋白負(fù)電基團(tuán)發(fā)生離子反應(yīng)而與蛋白結(jié)合，從而使蛋白電荷下降，油體間排斥力減弱，導(dǎo)致油滴發(fā)生聚合[22-23, 25]。其中Ca2+與蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)于Mg2+[33]，導(dǎo)致更大程度的電中和效應(yīng)，使蛋白聚集程度增強(qiáng)，即油體聚合程度增強(qiáng)，因此含Ca2+的乳狀液穩(wěn)定性更低。

由于CaCl2破乳率最高，因此下面選擇CaCl2為破乳劑。

注：圖中不同小寫字母表示數(shù)值間差異顯著（P<0.05），下同。

2.1.2 CaCl2對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

圖2為不同溫度下CaCl2對(duì)破乳率的影響。圖2顯示在各反應(yīng)溫度下（60、70、80 ℃），添加CaCl2的乳狀液破乳率均高于未添加的空白樣，特別是在較低CaCl2濃度時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了較好的破乳效果，說明CaCl2有效降低了乳狀液的穩(wěn)定性。

CaCl2濃度和反應(yīng)時(shí)間的增加均會(huì)導(dǎo)致破乳率的上升，各濃度CaCl2破乳率變化曲線顯示反應(yīng)初始10 min時(shí)，破乳率提升最明顯，但實(shí)現(xiàn)徹底破乳（破乳率100%）后，破乳率變化曲線隨反應(yīng)時(shí)間的延長出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這種破乳率受反應(yīng)時(shí)間影響的變化規(guī)律也出現(xiàn)在Jung等[35]的研究結(jié)果中。另外，CaCl2破乳效果受反應(yīng)溫度的影響較大，隨反應(yīng)溫度升高，破乳率相應(yīng)增加，實(shí)現(xiàn)徹底破乳的時(shí)間縮短，這與空白樣隨溫度變化趨勢(shì)一致。

本試驗(yàn)中含0.02 mol/L CaCl2的乳狀液在70、80 ℃分別反應(yīng)90、30 min時(shí)實(shí)現(xiàn)徹底破乳，含0.04 mol/L CaCl2的乳狀液在60、70、80 ℃分別反應(yīng)90、50、30 min，實(shí)現(xiàn)徹底破乳，而含更高濃度CaCl2的乳狀液在各反應(yīng)溫度下實(shí)現(xiàn)徹底破乳的時(shí)間更短，本著節(jié)約能源和降低無機(jī)鹽使用量的原則，CaCl2破乳條件適宜選擇70 ℃時(shí)較低濃度的CaCl2。因此下面CaCl2濃度對(duì)乳狀液相關(guān)性質(zhì)的影響僅在70 ℃條件下進(jìn)行，而反應(yīng)溫度對(duì)乳狀液的影響僅在CaCl2添加量為0.02 mol/L時(shí)研究。

圖2 不同溫度下CaCl2對(duì)破乳率的影響

2.2 pH值對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

圖3為不同pH值條件下的破乳率。圖3顯示在pH值9時(shí)，乳狀液最穩(wěn)定，破乳率最低。隨pH值的降低，破乳率逐漸上升，特別當(dāng)乳狀液pH值降至3～4時(shí)，破乳率最高，達(dá)100%，但隨pH值的進(jìn)一步降低，破乳率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

注：反應(yīng)溫度：50 ℃；反應(yīng)時(shí)間：30 min。

Chabrand等[36]采用水酶法提取大豆油，產(chǎn)生的乳狀液在50 ℃等電點(diǎn)處反應(yīng)3 h，破乳率達(dá)最高，為83%。同是利用蛋白等電點(diǎn)降低乳狀液穩(wěn)定性，但破乳效果卻存在差異，主要原因在于物料前處理方式和水酶法提油階段酶種類的不同。不同于本試驗(yàn)粗酶液中含有堿性蛋白酶，Chabrand水酶法提油僅采用中性蛋白酶，中性蛋白酶水解蛋白生成乳化性差的短肽能力較弱，因此乳狀液具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[37]。另外，本試驗(yàn)豆粉采用擠壓膨化預(yù)處理工藝，膨化后的物料更有利于酶對(duì)蛋白的充分水解，產(chǎn)生穩(wěn)定性較低的乳狀液[38]，而Chabrand采用普通粉碎，所得乳狀液穩(wěn)定性較高，導(dǎo)致pH值對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響不顯著。因此水酶法提油工藝條件的不同會(huì)使所得乳狀液穩(wěn)定性存在差異，導(dǎo)致相同破乳方法破乳效果不同。

2.3 CaCl2和pH值對(duì)乳狀液黏度的影響

圖4為CaCl2和pH值對(duì)乳狀液黏度的影響。圖4a顯示在60～80 ℃時(shí)，添加CaCl2的乳狀液黏度明顯低于未添加的空白樣，說明CaCl2促進(jìn)了乳狀液黏度的下降；隨溫度上升，添加CaCl2的樣品黏度相應(yīng)降低。CaCl2濃度的增加也會(huì)導(dǎo)致乳狀液黏度進(jìn)一步降低（圖4b）。乳狀液黏度越低意味著油珠運(yùn)動(dòng)所受黏滯阻力越小，油滴更易于聚集[12]，因此更高反應(yīng)溫度或含更高濃度CaCl2的乳狀液穩(wěn)定性較低，破乳率較高。

圖4c顯示乳狀液黏度隨pH值的降低而下降。pH值在7和9時(shí)，乳狀液黏度最高，在pH值3～4.5附近乳狀液黏度較低，此時(shí)油滴運(yùn)動(dòng)所受黏滯阻力較弱，油滴運(yùn)動(dòng)速度和聚合機(jī)率增加，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性變差，因此破乳率較高，達(dá)97%以上。

注：圖4a與4b中反應(yīng)時(shí)間：20 min；圖4c中反應(yīng)溫度：50 ℃，反應(yīng)時(shí)間：30 min。pH值分別為4、6、8時(shí)的乳狀液粘度分別與pH值為3、7、9的乳狀液相似（重疊），故圖4c中沒有顯示。

2.4 CaCl2 和pH值對(duì)乳狀液Zeta電位的影響

圖5為CaCl2和pH值對(duì)乳狀液電位的影響。由圖5a～5b可知未加CaCl2的空白樣所帶負(fù)電荷最高，添加CaCl2后乳狀液所帶負(fù)電荷量明顯減少，而且CaCl2濃度和反應(yīng)溫度的增加均會(huì)導(dǎo)致乳狀液負(fù)電荷的進(jìn)一步降低。值得注意的是，隨溫度上升，未加CaCl2的空白樣電位變化不顯著（<0.05），但是添加CaCl2的乳狀液電位受溫度影響較大。

注：圖5a與5b中反應(yīng)時(shí)間：20 min；圖5c中反應(yīng)溫度：50 ℃，反應(yīng)時(shí)間：30 min。圖5c中pH值分別為6和8時(shí)的乳狀液電位分別相似于pH值為7和9時(shí)，故圖中沒有顯示。

蛋白中的負(fù)電荷主要來自于蛋白鏈中酸性氨基酸解離的COO-，受熱時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)伸展并暴露出這些帶電基團(tuán)[26]，當(dāng)pH值遠(yuǎn)離蛋白等電點(diǎn)時(shí)，二價(jià)陽離子，諸如Ca2+，Zn2+，Mg2+均會(huì)與帶負(fù)電荷的COO-反應(yīng)[22]，產(chǎn)生電中和效應(yīng)，降低負(fù)電量。由于本試驗(yàn)所得乳狀液pH值不在等電點(diǎn)處，因此受熱時(shí)CaCl2解離的Ca2+與蛋白負(fù)電基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白所帶負(fù)電荷降低，這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在Jia等[22-23]的研究中。這種Ca2+與負(fù)電基團(tuán)之間的離子反應(yīng)降低了蛋白電位，減弱了蛋白間靜電排斥力，易于油滴聚集[24]，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性下降。而提高受熱溫度可加速Ca2+的解離，并為蛋白結(jié)構(gòu)伸展提供更多的能量，使帶電基團(tuán)充分暴露，更易于Ca2+與帶電基團(tuán)反應(yīng)[22,25]，導(dǎo)致Zeta電位進(jìn)一步降低，因此增加反應(yīng)溫度或CaCl2濃度均會(huì)使乳狀液破乳率提升。

由圖5c可知乳狀液在不同pH值時(shí)的電位值差異顯著。在pH值為7和pH值為9時(shí)，乳狀液所帶負(fù)電荷最高，隨pH值降低，乳狀液所帶負(fù)電荷逐漸減少，特別在pH值為3和pH值為4時(shí)，所帶電荷最低，接近0，說明此時(shí)為乳狀液蛋白等電點(diǎn)。但當(dāng)pH值繼續(xù)降低至2時(shí)，Zeta絕對(duì)值再次升高，此時(shí)蛋白帶正電荷。這種乳狀液電位值受pH值影響的變化趨勢(shì)與前人研究結(jié)果相似[14, 26]。

由于乳狀液中包裹在油體外圍的蛋白帶有電荷，使油體間存在靜電排斥力，抑制了油體聚合，因此乳狀液具有一定的穩(wěn)定性。在pH值為7和pH值為9時(shí)乳狀液電位絕對(duì)值最大，此時(shí)油體間存在較大排斥力，乳狀液具有良好的穩(wěn)定性，因此破乳率最低。當(dāng)乳狀液pH值處于3～4時(shí)，此時(shí)電位絕對(duì)值最小，油體間靜電排斥力幾乎消失，油體發(fā)生聚集[39]，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性下降，破乳率達(dá)到最高。

本試驗(yàn)中水酶法提油階段酶將蛋白水解成小分子的短肽[12]，造成表面電荷改變，導(dǎo)致所得乳狀液中蛋白等電點(diǎn)不在pH值4.5處，而偏移至pH值3～4。

2.5 CaCl2 和pH值對(duì)乳狀液粒徑分布與平均粒徑的影響

圖6為CaCl2和pH值對(duì)乳狀液粒徑分布與平均粒徑的影響。由圖6a～圖6d可知，在各反應(yīng)溫度下，添加CaCl2的乳狀液油滴粒徑分布曲線均位于空白樣右側(cè)，油滴平均粒徑增加顯著，說明CaCl2有效促進(jìn)了乳狀液中油滴的聚合。隨反應(yīng)溫度的提升，含CaCl2的乳狀液油滴粒徑分布曲線相應(yīng)右移（圖6a)，平均粒徑增加顯著（圖6b)；而CaCl2濃度的增加也會(huì)導(dǎo)致更大程度的油脂聚集和油滴平均粒徑的增加（圖6c～圖6d）。

由于Ca2+與蛋白中負(fù)電基團(tuán)的電中和作用，使油體間靜電排斥力減弱，同時(shí)Ca2+還可在蛋白間形成鹽橋，促使蛋白發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致油滴聚合[22]。提升溫度不僅可增強(qiáng)Ca2+與蛋白的反應(yīng)，進(jìn)一步減弱油體間靜電排斥力（圖5a），而且空白樣粒徑分布曲線顯示提升溫度還可加速油體運(yùn)動(dòng)速率，促進(jìn)油滴聚集（圖6a與圖6b），因此提高溫度可使含CaCl2乳狀液油滴聚集程度增強(qiáng)；更高濃度的CaCl2會(huì)導(dǎo)致更大程度的電位絕對(duì)值下降（圖5b），使油滴更易于聚集。

注：圖6a~ 6d中反應(yīng)時(shí)間：20 min；圖6e、6f中反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min。圖6e~6f中pH值分別為4、6、8時(shí)的乳狀液粒徑分布與平均粒徑分別相似于pH值為3、7、9時(shí)的乳狀液，故圖中沒有顯示。

圖6e～6f顯示pH值的降低有效促進(jìn)了乳狀液中油滴的聚集，導(dǎo)致油滴平均粒徑增大。乳狀液pH值為9時(shí)油滴粒徑分布曲線呈現(xiàn)2個(gè)明顯的峰，且均處于較小直徑范圍內(nèi)（圖6e），說明此時(shí)油滴粒徑分布不均，乳狀液較穩(wěn)定；隨pH值的降低，乳狀液油滴粒徑分布曲線相應(yīng)右移，且僅有一個(gè)明顯可見峰，油珠平均粒徑增加顯著（<0.05），說明油滴發(fā)生聚合，乳狀液穩(wěn)定性下降。特別是當(dāng)乳狀液pH值在3和4.5時(shí)，由于油滴間靜電排斥力較低（圖5c），油滴易于聚合，因此pH值為3和pH值為4.5時(shí)的油滴粒徑分布曲線處于粒徑分布圖的最右側(cè)，二者幾乎重合，油滴平均粒徑也達(dá)到最大值，此時(shí)乳狀液穩(wěn)定性最差，破乳率最高，分別為100%，97%。

2.6 破乳前后乳狀液微結(jié)構(gòu)變化

經(jīng)蘇丹紅Ⅲ和考馬斯亮蘭染色后的乳狀液光鏡圖片顯示未破乳的乳狀液中油珠粒徑普遍較小，且油珠外面包裹著一層明顯的藍(lán)色膜（圖7a），由考馬斯亮蘭可將蛋白染成藍(lán)色的特性可知這層藍(lán)色膜即為由蛋白組成的油水界面膜。當(dāng)添加CaCl2后或者將乳狀液pH值調(diào)至4.5時(shí)，由于油珠間靜電排斥力減弱，油滴發(fā)生聚合，此時(shí)乳狀液中油滴粒徑比破乳前明顯增大（圖7b～圖7c）。圖7b和圖7c中深色部分為由于電荷降低導(dǎo)致凝集的蛋白。

未完全破乳的乳狀液離心后油相與水相之間存在著較厚的乳狀層（圖7e），還有部分油殘存其中未釋放；而徹底破乳的乳狀液離心后，油、水相之間無乳狀層存在，油脂全部釋放，乳狀液中的蛋白沉淀在管的底部（圖7d）。

圖7 破乳前后乳狀液的微結(jié)構(gòu)及破乳離心后的乳狀液圖片

3 結(jié) 論

針對(duì)粗酶水相提取大豆油過程中所形成的乳狀液，采用添加無機(jī)鹽和調(diào)節(jié)pH值的方式進(jìn)行破乳。試驗(yàn)結(jié)果顯示添加CaCl2（0.02～0.08 mol/L）或者降低乳狀液pH值（3～9）均可降低乳狀液的穩(wěn)定性，其機(jī)理為CaCl2的添加或體系pH值的降低均使乳狀液電位絕對(duì)值和黏度下降，促使油滴發(fā)生聚合，油滴平均粒徑增大，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低。CaCl2濃度和反應(yīng)溫度的增加，促使乳狀液電位絕對(duì)值和黏度下降程度增強(qiáng)，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性進(jìn)一步降低。添加0.04 mol/L CaCl2的乳狀液在60、70、80 ℃分別反應(yīng)90、50、30 min均可實(shí)現(xiàn)徹底破乳；而調(diào)節(jié)乳狀液pH值至3～4，50 ℃作用30 min時(shí)破乳率達(dá)100%。光鏡圖片顯示破乳前后乳狀液微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異。本研究為CaCl2和pH值破乳技術(shù)提供了試驗(yàn)參考和理論依據(jù)，有益于水酶法提油技術(shù)的應(yīng)用與推廣。

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Effect of CaCl2and pH value on demulsification of emulsion from enzyme-assisted aqueous extraction processing of soybean oil

Wu Haibo1, Jiang Lianzhou2※

(1.535011,; 2.150030,)

To explore the demulsification mechanism of emulsion recovered from crude enzyme-assisted aqueous extraction processing of extruded full fat soybean flour,the effect of salt and pH value on the emulsion stability was investigated respectively by demulsification rate, Zeta potential, apparent viscosity, particle size distribution and mean oil particle size. For evaluating the efficiency of salt demulsifying the emulsion, CaSO4, CaCl2, MgCl2, NaCl were separately added into the emulsion at concentration 0.06 mol/L, reaction time 10 min, and temperature 80 ℃. The experiment results showed 4 salts significantly destabilized the emulsion, but the highest free oil yield was recoveried from the emulsion added with CaCl2,followed by CaSO4, MgCl2,NaCl. Although the emulsion added with CaCl2was completely broken (100% free oil recovery) at 60, 70, 80 ℃respectively, demulsification effect was impacted by CaCl2concentration, reaction time, reaction temperature. Demulsification rate progressively rose with CaCl2concentrations increasing from 0.02 to 0.08 mol/L, reaction times from 0 to 90 min, reaction temperatures from 60 to 80 ℃. However, demulsification rate decreased with the increase of reaction time after the emulsion was completely broken. As Ca2+neutralised the negative charge of the protein during heating, apparent viscosity and the absolute value of Zeta potential of the emulsion added with CaCl2declined significantly compared with the control (without CaCl2addition), which induced oil droplets aggregate and mean oil droplet size increase so that the stability of the emulsion decreased.Due to the greater screening effect of the higher Ca2+concentration and reaction temperature on the negatively charged groups of proteins, the increase of CaCl2concentrations ranging from 0.02 to 0.08 mol/L and reaction temperatures from 60 to 80 ℃further reduced the absolute value of Zeta potential and apparent viscosity of the emulsion, and promoted the oil droplets aggregation. This resulted the higher free oil recovery. With pH value decreasing from 9 to 3 at 50 ℃, the absolute value of Zeta potential and apparent viscosity of the emulsion declined significantly, the average oil particle size increased so that the stability of the emulsion reduced, and the free oil recovery increased. Specially, the stability of the emulsion was the lowest and free oil recovery achieved the highest (100% free oil recovery) at pH value 3-4 because the absolute value of Zeta potential reached the lowest level (closed to 0), which meant the electrostatic repulsion forces between protein molecules of the emulsion nearly disappeared. When pH value dropped below 3, however, the absolute value of Zeta potential and apparent viscosity of the emulsion increased again so that the mean oil droplet size and demulsification rate decreased. Light micrographs showed that there were significant differences in the microstructure and oil recovery of the emulsion before and after demulsification. Oil drop diameter of the emulsion apparently enlarged, and more free oil was released after demulsification and centrifugation. This research can provide the theory foundation of destabilization strategies for the emulsion formed during enzyme-assisted aqueous extraction processing of soy oil.

hydrolysis; emulsions; stability; enzyme-assisted aqueous extraction; demulsification

吳海波，江連洲.CaCl2和pH值對(duì)水酶法提取大豆油形成乳狀液破乳效果影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2018，34(23)：299－306. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.23.038 http://www.tcsae.org

Wu Haibo, Jiang Lianzhou.Effect of CaCl2and pH value on demulsification of emulsion from enzyme-assisted aqueous extraction processing of soybean oil[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(23): 299－306. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.23.038 http://www.tcsae.org

2018-7-21

2018-10-18

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（3143000560）

吳海波，副研究員，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。Email：haibowu2004@sina.com

江連洲，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。Email：lzjname@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.23.038

TS224.2

A

1002-6819(2018)-23-0299-08