大蒜化學(xué)成分(組)對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

許 良，李瑞瑞，李心雨，宋百靈，李新霞*，肖文浚

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊 830011)

大蒜(AlliumsativumL.)是蔥屬植物大蒜的鱗莖，歷史悠久，是人類種植的最古老的具有藥效的植物[1]。大蒜化學(xué)成分的多樣性是大蒜防病治病的基礎(chǔ)，具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗心肌缺血、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[4]，主要用于抗炎[5]、抗癌、治療心腦血管疾病[6]和糖尿病[7]。目前，研究認(rèn)為大蒜的活性作用主要是含硫氨基酸蒜氨酸在蒜酶的催化裂解下產(chǎn)生的大蒜辣素及其降解產(chǎn)物[8-9]通過(guò)代謝為H2S產(chǎn)生的。當(dāng)大蒜組織破碎后，存在于大蒜細(xì)胞溶膠中的蒜氨酸與存在于液泡中的蒜酶相遇[10]產(chǎn)生大蒜辣素[9,11-12]。大蒜辣素不穩(wěn)定，遇熱或有機(jī)溶媒降解生成大蒜素及其他化合物。研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其分泌細(xì)胞因子的能力，從而提高細(xì)胞的活性，進(jìn)一步加強(qiáng)免疫作用[13]。

涉及到大蒜增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的文獻(xiàn)大多采用大蒜水提物或乙醇提取物[14-16]、大蒜辣素的降解產(chǎn)物大蒜素和大蒜油[17-18]以及乙醇提取的大蒜多糖[19](garlicpolysaccharide)等。

本實(shí)驗(yàn)建立免疫功能低下模型，分別從小鼠血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)及細(xì)胞分子水平免疫調(diào)節(jié)等方面，研究大蒜提取物、蒜氨酸+多糖不同劑量和大蒜多糖對(duì)免疫抑制小鼠的免疫增強(qiáng)作用，為大蒜各化學(xué)成分提高機(jī)體免疫力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 Multiskan GO全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；AB135-S型分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(徠卡儀器有限公司)等。

1.2試藥 注射用環(huán)磷酰胺(批號(hào)17080125，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；左旋咪唑片(批號(hào)161201，山東仁和堂藥業(yè)有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(Elabscience公司)。

大蒜多糖(總糖含量75.2%，批號(hào)20170925)，大蒜提取物(蒜氨酸含量3.94%，潛在大蒜辣素1.8%，總糖含量41%，批號(hào)20161201，采用冷凍干燥技術(shù)的大蒜凍干粉)，蒜氨酸提取物(蒜氨酸含量4.58%，總糖含量80%，批號(hào)20171010)，均購(gòu)自新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司。

1.3動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠192只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房，許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0003。

2 方法

2.1動(dòng)物分組處理 將小鼠分為2批，每批隨機(jī)分為8組，每組24只。①正常對(duì)照組；②模型對(duì)照組；③陽(yáng)性對(duì)照組(左旋咪唑溶液，25 mg·d-1·kg-1)；④大蒜多糖組 (164 mg·d-1·kg-1)；⑤蒜氨酸+多糖高劑量組(以alliin計(jì)，60 mg·d-1·kg-1)；⑥蒜氨酸+多糖中劑量組(以alliin計(jì)，17.5 mg·d-1·kg-1)；⑦蒜氨酸+多糖低劑量組(以alliin計(jì)，5 mg·d-1·kg-1)；⑧大蒜提取物組(以大蒜多糖計(jì)，164 mg·d-1·kg-1)。①和②組灌胃生理鹽水，②至⑧組小鼠從灌胃的第23天開始，按照1 g體質(zhì)量0.01 mL的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg·d-1·kg-1)，連續(xù)注射7 d，末次注射給藥后禁食12 h，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。按照每只1 g體質(zhì)量0.02 mL共灌胃30 d，實(shí)驗(yàn)期間，小鼠正常飲食和光照。

各組給藥劑量見(jiàn)表1。用以研究大蒜各化學(xué)成分(組)對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能恢復(fù)狀況。

表1小鼠的給藥劑量

Tab.1 Dosages for mice

組別以多糖計(jì)/mg·kg-1以alliin計(jì)/mg·kg-1以大蒜辣素計(jì)/mg大蒜多糖組16400蒜氨酸+多糖高劑量組1 048600蒜氨酸+多糖中劑量組30617.50蒜氨酸+多糖低劑量組8750大蒜提取物組16408.4

2.2測(cè)定指標(biāo)及方法

2.2.1白細(xì)胞計(jì)數(shù) 第30天給藥后小鼠禁食12 h，摘眼球取血，加入白細(xì)胞稀釋液后于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)，1 μL(每立方毫米)血中白細(xì)胞總數(shù)=4格白細(xì)胞總數(shù)×50。

2.2.2ELASA法測(cè)定血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平 取血液，離心取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定各組小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量。

3 結(jié)果

3.1對(duì)免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響 見(jiàn)圖1。與模型組比較，除大蒜提取物組外，均可提高環(huán)磷酰胺降低的白細(xì)胞數(shù)(P<0.05 或P<0.01)，可見(jiàn)大蒜化學(xué)成分(組)對(duì)環(huán)磷酰胺所致的外周血白細(xì)胞減少有恢復(fù)功能，且具有正向免疫調(diào)節(jié)作用。

圖1大蒜化學(xué)成分(組)對(duì)免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.05；與CTX模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

Fig.1 Effect of garlic chemical composition (groups) on peripheral blood white blood cell count in immunosuppressed mice

Note：Compared with the normal control group*P<0.05； compared with the CTX model group△P<0.05，△△P<0.01.

3.2對(duì)免疫抑制小鼠血清IL-6、IFN-γ和TNF-α水平的影響 見(jiàn)圖2。與模型組比較，大蒜多糖組、蒜氨酸+多糖高劑量組和中劑量組可明顯恢復(fù)環(huán)磷酰胺降低的IL-6水平；大蒜多糖組、蒜氨酸+多糖高劑量組、中劑量組和大蒜提取物組均可明顯恢復(fù)環(huán)磷酰胺降低的IFN-γ水平；各給藥組均可恢復(fù)環(huán)磷酰胺降低的TNF-α水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。

圖2大蒜化學(xué)成分(組)對(duì)免疫抑制小鼠血清IL-6、TNF-α和IFN-γ水平的影響

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與CTX模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

Fig.2 Effect of garlic chemical composition (groups) on serum IL-6，TNF-αand IFN-γlevels in immunosuppressed mice

Note：Compared with the normal control group*P<0.05，**P<0.01； compared with the CTX model group△P<0.05，△△P<0.01.

以血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比各成分組藥效關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，大蒜多糖與大蒜提取物對(duì)比，僅有多糖單一成分的效果不如含硫化合物協(xié)同作用效果好，而蒜氨酸+多糖的協(xié)同效果又優(yōu)于大蒜提取物組。

圖3大蒜各成分組藥效關(guān)系對(duì)比

注：橫坐標(biāo)為多糖含量。蒜氨酸+多糖低劑量(以大蒜多糖計(jì)，87 mg·d-1·kg-1)；大蒜多糖(164 mg·d-1·kg-1)；大蒜提取物 (以大蒜多糖計(jì)，164 mg·d-1·kg-1)；蒜氨酸+多糖中劑量組(以大蒜多糖計(jì)，306 mg·d-1·kg-1)；蒜氨酸+多糖高劑量組(以大蒜多糖計(jì)，1 048 mg·d-1·kg-1)。

Fig.3 Comparison of the pharmacodynamic relationship between garlic components

Note：The abscissa is the polysaccharide content，polysaccharide content was arranged from small to large on the abscissa.alliin+polysaccharide low dose group (garlic polysaccharide，87 mg·d-1·kg-1)； garlic polysaccharide (164 mg·d-1·kg-1)； garlic extract (garlic polysaccharide，164 mg·d-1·kg-1)； alliinic acid+polysaccharide middle dose group (garlic polysaccharide，306 mg·d-1·kg-1)； alliinic acid+polysaccharide high dose group (garlic polysaccharide，1 048 mg·d-1·kg-1).

3.3對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 見(jiàn)圖4。與模型組比較，大蒜多糖組、蒜氨酸+多糖中劑量組、低劑量組和大蒜提取物組均可明顯恢復(fù)環(huán)磷酰胺降低的免疫抑制小鼠碳廓清指數(shù)K；蒜氨酸+多糖中劑量組、低劑量組和大蒜提取物組可恢復(fù)環(huán)磷酰胺降低的免疫抑制小鼠的吞噬指數(shù)α(P<0.05或P<0.01)。蒜氨酸+多糖各劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4大蒜化學(xué)成分(組)對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.05；與CTX模型組比較△P<0.05。

Fig.4 Effect of garlic chemical composition (groups) on phagocytosis of macrophages in immunosuppressed mice

Note：Compared with the normal control group*P<0.05； compared with the CTX model group△P<0.05.

4 討論

本實(shí)驗(yàn)中，大蒜提取物組除水分外保留了大蒜原有的所有成分，包括蒜氨酸(3.94%)、大蒜多糖(41%)及有活力的蒜酶；臨用前加水、蒜氨酸和蒜酶反應(yīng)生成大蒜辣素(潛在大蒜辣素1.8%)；蒜氨酸+多糖組(含蒜氨酸4.58%，大蒜多糖80%)是經(jīng)鮮蒜滅酶后提取，不含蒜酶；大蒜多糖組(含大蒜多糖80%)既不含蒜酶也不含蒜氨酸。大蒜各成分組(表1)藥效關(guān)系對(duì)比，結(jié)果顯示，蒜氨酸+多糖中劑量組和大蒜多糖組均能升高由造模導(dǎo)致的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、碳廓清指數(shù)K和血清中IL-6、IFN-γ及TNF-α水平下降(P<0.05)；蒜氨酸+多糖低劑量組可升高由造模導(dǎo)致的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、碳廓清指數(shù)K和血清中TNF-α水平下降；蒜氨酸+多糖高劑量組可升高由造模導(dǎo)致的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α水平下降；大蒜提取物組可升高由造模導(dǎo)致的碳廓清指數(shù)K和血清中IFN-γ，TNF-α水平下降。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜各成分組均可升高免疫因子水平，對(duì)免疫抑制小鼠的免疫功能具有正向調(diào)節(jié)作用，但無(wú)劑量依賴關(guān)系，無(wú)論是單一成分還是組合成分，均可將免疫功能提升到趨近于正常水平，建議根據(jù)成本優(yōu)化組合設(shè)計(jì)產(chǎn)品處方。