游路寬，鄭 軒，胡 毅

解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)中國國家癌癥中心統(tǒng)計，2015年我國大約有733 300例新發(fā)肺癌患者；同年，約有610 200例肺癌患者死亡，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首[1]。非小細胞肺癌占所有肺癌病例數(shù)80%左右，包括鱗癌(squamous cell lung cancer，SCLC)、腺癌和大細胞肺癌等病理類型，其中約30%為肺鱗癌[2]。近年來，針對驅(qū)動基因突變的分子靶向治療在肺腺癌方面表現(xiàn)不俗，而在肺鱗癌方面卻一直沒有突破性進展。目前已有研究表明，許多抑癌基因和致癌基因的功能失調(diào)及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)異常參與了肺鱗癌發(fā)生發(fā)展的過程[3-4]，但確切機制尚不明確。因此，進一步探索肺鱗癌發(fā)生的病因?qū)W因素、分子機制和途徑對于優(yōu)化診斷和治療的意義重大。基因芯片是一種高通量獲取生物信息的技術，能高效檢測并分析腫瘤組織和癌旁組織的差異表達基因。本研究擬通過分析基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)提供的肺鱗癌相關基因芯片數(shù)據(jù)，篩選差異表達基因，并對這些基因進行關鍵基因和信號通路等生物信息學分析，為進一步在分子水平研究肺鱗癌發(fā)生發(fā)展機制和其臨床靶向治療研究提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 數(shù)據(jù)集 于2018年6月3日通過GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫下載肺鱗癌基因芯片數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)集均需符合以下條件：1)數(shù)據(jù)集來自全基因組RNA表達芯片；2)實驗使用人類肺鱗癌組織與正常組織對照。

2 方法 在R語言(https：//www.r-project.org)中，對肺鱗癌基因芯片原始數(shù)據(jù)的探針進行注釋和過濾后，使用Bioconductor(http：//www.bioconductor.org)提供的RMA(Robust Multi-array Average)算法對各原始芯片數(shù)據(jù)進行背景校正及歸一化等預處理。采用Limma(Linear Models for Microarray Data)程序包對腫瘤組織和正常組織樣本的基因表達值進行比對識別差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。選取調(diào)整后的P＜0.05且表達倍數(shù)變化值的對數(shù)值(log2fold change，log2FC)絕對值＞1為閾值，獲得各數(shù)據(jù)集的差異表達基因。采用韋恩圖取交集的方法獲取各數(shù)據(jù)集共有差異表達基因。利用DAVID6.8(https：//david.ncifcrf.gov)對共有差異表達基因進行基因本體論(gene ontology，GO)和信號通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富 集 分 析。 利 用STRING10.5(https：//string-db.org)對共有差異表達基因編碼蛋白的相互作用進行網(wǎng)絡分析。利用Cytoscape_v3.6.1軟件插件MCODE(Molecular Complex Detection)和Cytohubba分別尋找蛋白相互作用網(wǎng)絡中與肺鱗癌發(fā)生發(fā)展相關的核心模塊和關鍵基因，并分析核心模塊相關的生物學功能及關鍵基因表達與肺鱗癌患者生存的關系。

結(jié) 果

1 基因芯片數(shù)據(jù)集匯總 通過GEO數(shù)據(jù)庫查詢肺鱗癌相關研究并篩選抽提樣本，共納入2套基因芯片數(shù)據(jù)集(表1)。

2 差異表達基因分析 2套基因芯片集GSE30219、GSE3268分別篩選出差異表達基因2 467個和802個，其中表達上調(diào)基因分別為1 082個和327個，表達下調(diào)基因分別為1 385個和475個。為了減少差異表達基因篩選結(jié)果的假陽性率，我們使用韋恩圖取交集的方法，確定兩芯片集共同的差異表達基因628個，其中表達上調(diào)基因263個，表達下調(diào)基因365個，這些基因被用作后續(xù)分析(圖1)。

圖1 GSE30219和GSE3268數(shù)據(jù)集差異表達基因分析結(jié)果(上)及韋恩圖法取共同差異表達基因(下)Fig.1 Result of DEGs in GSE30219 and GSE3268 Datasets and Venn diagram for DEGs

3 共有差異表達基因的GO和KEGG pathway富集分析 基因本體論(Gene Ontology)包括分子功能、生物過程和細胞組成三部分。GO和KEGG pathway分析，均利用超幾何分布關系將差異表達基因富集在某些基因功能和信號通路上，進而推測腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能與這些基因功能或信號通路的改變有關。使用DAVID對628個共有差異表達基因中的263個表達上調(diào)基因和365個表達下調(diào)基因分別進行GO和KEGG pathway分析。表達上調(diào)的差異基因：功能主要富集在表皮發(fā)育、細胞分裂及DNA復制等，通路主要富集在細胞周期、細胞外基質(zhì)受體相互作用及p53信號通路等。表達下調(diào)的差異基因：功能主要富集在白細胞遷移、細胞黏附和信號傳導等，通路主要富集在補體和凝血級聯(lián)反應、細胞黏附及吞噬等(表2、表3)。4 編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 為分析共有差異表達基因之間相互關系，利用STRING10.5(https：//string-db.org)在線工具對628個差異表達基因進行編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡關系(protein-protein interaction network，PPI)構(gòu)建，設置最低要求的相互作用分數(shù)為0.9，得到了由621個節(jié)點、927條連線構(gòu)成的相互作用關系圖。為了尋找該編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡中與肺鱗癌發(fā)生發(fā)展相關的核心模塊和關鍵基因并初步探索其生物學功能，采用Cytoscape_v3.6.1軟件插件MCODE對該蛋白相互作用網(wǎng)絡進行分析，得到了由19個共表達基因構(gòu)成的核心模塊，除MLF1IP基因外，其余18個基因均為上調(diào)的差異表達基因(圖2)。對該核心模塊進行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其參與的重要生物學過程主要是細胞分裂、蛋白質(zhì)泛素化分解代謝、姐妹染色單體結(jié)合與分離、G2/M期有絲分裂細胞周期轉(zhuǎn)變等過程，參與的主要信號通路有細胞周期和P53信號通路等(圖3)。最后利用Cytoscape_v3.6.1軟件插件cytohubba，采用MCC(Maximal Clique Centrality)算法得到MAD2L1、CCNB1、DLGAP5、CDC20、TOP2A、MELK、BUB1B、CCNA2、CDK1、CCNB2這10個在差異表達基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點基因。碰巧的是，這10個關鍵基因均為肺鱗癌組織中上調(diào)的差異表達基因。除TOP2A基因外，其余9個關鍵基因同時存在于前面分析的核心模塊中。最后為初步探索這10個關鍵基因的表達與肺鱗癌患者預后的關系，我們采用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)中肺鱗癌樣本數(shù)據(jù)對10個關鍵基因進行了生存分析，發(fā)現(xiàn)這10個關鍵基因的表達情況與肺鱗癌患者的預后顯著相關(P＜0.000 1)，表達越高預后越差(圖4)。

表1 納入的2套肺鱗癌基因芯片基本信息Tab. 1 Basic information for two sets of SCLC microarray

表2 共有差異表達基因的GO分析Tab. 2 Gene ontology analysis of differentially expressed genes

表3 共有差異表達基因的KEGG pathway分析Tab. 3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

討 論

近年來，得益于PD1/PD-L1免疫治療及其他化療藥物及方案的應用，肺鱗癌的治療取得了諸多進展，然而在靶向治療方面仍亟待突破。因此，對肺鱗癌分子病因?qū)W機制的深入了解非常必要。本研究對GEO中肺鱗癌相關芯片數(shù)據(jù)集進行分析，發(fā)現(xiàn)了肺鱗癌組織和正常組織的差異表達基因。對差異表達基因進行功能和通路富集分析，同時篩選出了與肺鱗癌發(fā)生發(fā)展及預后密切相關基因模塊和關鍵基因，為后續(xù)研究肺鱗癌治療提供了潛在標靶。

我們對差異表達基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，在生物學過程方面，上調(diào)的差異表達基因主要集中在細胞分裂，而下調(diào)的差異表達基因主要集中在細胞黏附和白細胞遷移。顯然，幾乎所有腫瘤的最基本特征是細胞的失控性生長，而細胞與細胞之間黏附功能的喪失又是腫瘤獲得侵襲性、轉(zhuǎn)移表型的重要步驟[5]。在分子功能方面，上調(diào)的差異表達基因主要集中在蛋白結(jié)合、細胞之間鈣黏素結(jié)合、細胞骨架結(jié)構(gòu)成分等，而下調(diào)的差異表達基因主要集中在整合素結(jié)合、離子通道結(jié)合等。鈣黏素是一種跨膜糖蛋白家族，主要參與同源細胞間的連接，其表達失調(diào)是癌癥發(fā)生過程中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的重要標志。當發(fā)生EMT時，上皮腫瘤細胞向間充質(zhì)樣細胞過渡，失去細胞間E-鈣黏蛋白的表達，并且獲得N-鈣黏蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達，使腫瘤細胞遷移并進入血流[6]。整合素是細胞黏附分子家族的重要成員之一，包括多種亞型，主要介導細胞與胞外基質(zhì)的雙向信號傳導。不少研究表明整合素參與并促進肺癌的腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，其中整合素αvβ3已成為眾多抗腫瘤血管生成藥物的靶點[7-8]。在通路富集分析方面，上調(diào)的差異表達基因主要集中在細胞周期、DNA復制、p53信號通路、鈣黏素相關作用等方面。p53基因是一種腫瘤抑制基因，且在所有人類腫瘤中突變率最高。由p53介導的細胞信號轉(zhuǎn)導通路在細胞正?；顒又凶饔脧V泛，對阻滯細胞周期、調(diào)節(jié)細胞凋亡、DNA損傷修復和抑制腫瘤血管生成中均發(fā)揮重要作用[9-11]。目前有研究表明p53基因突變可促進腫瘤生成和轉(zhuǎn)移，對治療的抗性和基因組不穩(wěn)定[12-13]。而下調(diào)的差異表達基因通路主要富集在補體與凝血級聯(lián)反應，細胞黏附分子、花生四烯酸代謝及PPAR信號通路。已有研究報道過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)可能以細胞類型依賴性方式在肺鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮雙向作用[14]。

通過對差異表達基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建并挖掘核心模塊，我們發(fā)現(xiàn)該核心模塊的功能主要集中在細胞分裂及細胞周期信號通路方面，從一定程度上反映了腫瘤失控性增長的特性。而篩選的10個關鍵基因通過TCGA數(shù)據(jù)庫中肺鱗癌樣本基因表達和生存數(shù)據(jù)分析，提示關鍵基因高表達是肺鱗癌患者預后較差的高風險因素。其中，DLGAP5基因編碼的蛋白DLG7，作為一種動力蛋白可穩(wěn)定染色體附近的微管[15]。目前在許多類型的人類癌癥如肝細胞癌、鱗狀細胞膀胱癌和移行細胞癌中均檢測到DLG7的高表達[16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)DLGAP5基因的沉默可引起NSCLC細胞周期停滯并抑制增殖，同時可抑制體外細胞的遷移和侵襲。此外，該基因的高表達也與患者較差的預后相關。MELK基因編碼母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶，該酶屬于AMPK/snf1蛋白激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶。研究顯示MELK通過磷酸化CDC25B和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1來促進增殖，并且MELK通過在Ser15位點磷酸化p53來誘導細胞凋亡[18]。目前該基因已作為抗癌藥物研究的靶標。但值得注意的是，Cheng等[19]通過實驗發(fā)現(xiàn)MELK在肺癌A549細胞系中的敲低抑制細胞增殖，卻促進了TGF-β存在下的細胞遷移。提示我們在腫瘤微環(huán)境中，存在TGF-β在內(nèi)的許多因子，倘若臨床上應用MELK抑制劑可能會促進患者的EMT和轉(zhuǎn)移。TOP2A基因編碼DNA拓撲異構(gòu)酶，該酶在轉(zhuǎn)錄過程中控制和改變DNA拓撲狀態(tài)，影響染色體濃縮與分離，促進腫瘤的發(fā)生[20-21]。目前FDA已批準幾種靶向TOP2A基因的抗癌劑上市。CDC20編碼細胞周期分裂蛋白20，其最主要的功能是激活后期促進復合物APC，啟動染色單體分裂并進入后期[22]。MAD2L1基因編碼的蛋白是有絲分裂紡錘體裝配檢查點的一個重要組成部分，可通過隔離CDC20抑制后期促進復合物的活性，確保所有染色體在分裂中期平板上排列對齊。有研究表明通過siRNA降低MAD2L1的表達可減少腫瘤細胞生長并抑制細胞遷移和侵襲[23]。其余的關鍵基因CDK1、CCNB1、CCNB2、CCNA2及 BUB1B均 編碼細胞周期進程中相關重要功能蛋白，影響細胞分裂生長，且有不少研究明確表明它們與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切[24-27]。

圖2 編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡圖(上)和MCODE插件確認的網(wǎng)絡核心模塊圖(下)Fig.2 Protein-protein interaction network for products of DEGs and subnetwork screened by MCODE plug-inNotes: Each dot represents a protein, and the interaction between the proteins is indicated by a line. The more protein links,the more important the position in the network is

圖3 編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡核心模塊基因的GO分析(上)和KEGG pathway分析(下)Fig.3 GO and KEGG pathway analysis of DEGs in the subnetwork of PPI network

本研究篩選出的差異基因和代謝通路可以幫助我們更深入地理解肺鱗癌潛在分子發(fā)生發(fā)展機制，同時為臨床治療的研究提供一定的理論依據(jù)，其靶向治療價值和意義有待后續(xù)研究證實。