張?chǎng)螑偅x瀟瀟，汪淑娟，游艷琴，汪龍霞，徐 虹，周紅輝，盧彥平

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1婦產(chǎn)科；2超聲診斷科

胎兒腎回聲增強(qiáng)是指妊娠17周后腎實(shí)質(zhì)的回聲大于肝和脾的回聲，目前為一項(xiàng)胎兒超聲檢查軟指標(biāo)。導(dǎo)致腎回聲增強(qiáng)形成原因較多，包括非遺傳性因素的阻塞性腎發(fā)育不良、雙側(cè)多囊腎、腎母細(xì)胞瘤、腎靜脈血栓形成、感染(巨細(xì)胞病毒、霉菌)以及代謝性疾病和腎病綜合征等；遺傳性因素包括染色體非整倍體異常(9、10、13、21-三體綜合征)、微缺失微重復(fù)綜合征、成人型和嬰兒型多囊腎、異常綜合征等；也可是正常腎的變異表現(xiàn)[1-2]。在腎回聲增強(qiáng)胎兒中，部分預(yù)后良好，部分會(huì)發(fā)展為早期腎衰，準(zhǔn)確判斷預(yù)后對(duì)遺傳咨詢和臨床處理非常重要[3]。由于胎兒腎回聲增強(qiáng)病因復(fù)雜，孕晚期產(chǎn)前診斷的窗口期短，如何對(duì)胎兒預(yù)后進(jìn)行判斷存在很大困難。本文對(duì)1例孕晚期胎兒腎回聲增強(qiáng)胎兒行產(chǎn)前診斷，依據(jù)結(jié)果對(duì)家系成員進(jìn)行篩查分析，為解決此類問題的產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢提供借鑒。

對(duì)象和方法

1 對(duì)象 先證者孕32周胎兒。2017年10月，孕婦因“胎兒雙腎回聲增強(qiáng)”轉(zhuǎn)診本院產(chǎn)前診斷中心行產(chǎn)前診斷。孕18周唐氏兒篩查結(jié)果均為低風(fēng)險(xiǎn)，孕24+1周排畸超聲未見明顯結(jié)構(gòu)異常。孕32周B超提示“胎兒雙腎回聲增強(qiáng)”，當(dāng)日轉(zhuǎn)診我院行產(chǎn)前診斷超聲檢查，提示胎兒左腎體積3.2 cm×2.6 cm×4.5 cm，皮質(zhì)回聲增強(qiáng)，腎盂分離前后徑約0.55 cm；右腎體積2.3 cm×1.9 cm×3.5 cm，皮質(zhì)回聲增強(qiáng)，內(nèi)可見多發(fā)大小不等的囊性結(jié)構(gòu)，大者約0.7 cm×0.6 cm×0.8 cm；未見其他系統(tǒng)明顯結(jié)構(gòu)異常。超聲印象：晚孕，單胎頭位；雙腎回聲增強(qiáng)，左腎體積增大，回聲增強(qiáng)，腎盂輕度分離，右腎多發(fā)小囊腔(圖1)。孕婦及丈夫自述平素體健，非近親結(jié)婚，均否認(rèn)家族遺傳性疾病。先證者明確病因后，調(diào)查其家系4名成員并抽取外周血行相應(yīng)檢測(cè)。所有被調(diào)查者均簽署知情同意書(胎兒由其父母代簽)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

2 血生化檢驗(yàn) 臍帶血2 ml行血生化分析，項(xiàng)目包括肝酶、肌酐、尿素等。

3 染色體核型分析 臍帶血2 ml送檢，進(jìn)行接種、培養(yǎng)、收獲、滴片及G顯帶分析。

4 CMA 胎兒臍血2 ml，成人外周血3 ml，選用單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)檢測(cè)。提取DNA，選擇CytoScan? 750K Array芯片(Affymetrix公司，美國)。DNA樣本經(jīng)限制性內(nèi)切酶NspⅠ消化、連接→進(jìn)行PCR擴(kuò)增→采用磁珠法純化擴(kuò)增產(chǎn)物→檢測(cè)其濃度(將DNA吸光度A260/A280波動(dòng)于1.8 ～ 2.0)→片段化處理→標(biāo)記→樣本變性與芯片雜交→芯片洗滌和染色→選用GCS 3 000 D×2(Affymetrix)掃描系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。結(jié)果采用Chromosome Analysis Suite (ChAS)軟件分析。

5 全外顯子組測(cè)序 胎兒臍血2 ml，成人外周血5 ml，采用天跟血液基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA。制備文庫，利用特異性探針與基因組DNA文庫序列進(jìn)行液體雜交，將目標(biāo)區(qū)域DNA片段進(jìn)行富集。采用羅氏Seq ZE Exome Enrichment Kit V2.0捕獲探針進(jìn)行人全外顯子組捕獲，覆蓋19 119個(gè)基因編碼區(qū)，總捕獲區(qū)間40 Mb。隨后行文庫雜交、洗滌，PCR擴(kuò)增，文庫質(zhì)檢，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)用 RTA軟 件 (real-time analysis，Illumina)分 析，CASAVAv1.8.2(Illumina)、BWA、GAT軟件評(píng)估測(cè)序質(zhì)量，獲得單核苷酸變異(SNV)報(bào)告。再使用ANNOVAR等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行變異注釋和分析。對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變區(qū)域進(jìn)行Sanger 測(cè)序驗(yàn)證，確定致病位點(diǎn)。

圖1 孕33周胎兒腎超聲圖像 上圖：胎兒左腎(LK)；下圖：胎兒右腎(RK)Fig. 1 Ultrasonic image of fetal kidneys up: the left kidney; down:the right kidney

結(jié) 果

1 胎兒臍血生化檢驗(yàn) 肌酐104.5(53 ～ 106)μmol/L，尿素 8.93(3.51 ～ 6.68) mmol/L，堿性磷酸酶 156(0 ～130) U/L，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶102.4(0 ～ 50) U/L，乳酸脫氫酶274.2(40 ～ 250) U/L，血清尿酸460(104 ～444) μmol/L。

2 胎兒染色體核型分析 G顯帶染色體核型分析結(jié)果為46，XN。

3 CMA SNP-array檢測(cè)結(jié)果 胎兒為arr 17q12(34，822，465-36，350，028)×1，即17號(hào)染色體17q12(34，822，465-36，350，028)區(qū)域存在1.5 Mb片段的缺失，內(nèi)含HNF1B (189907)， PIGW(610275)等 17個(gè)OMIM 基因。孕婦arr 16p13.11×1，arr 17q12×1，即 16p13.11區(qū)域存在 800 Kb缺失，17q12區(qū)域存在1.5 Mb缺失。丈夫及孕婦雙親檢測(cè)未見異常(圖2)。

4 全外顯子組測(cè)序 患胎PKHD1基因發(fā)現(xiàn)c.6794A＞T(p.His2265Leu)和c.5601-8C＞T復(fù)合雜合突變。突變c.6794A＞T為錯(cuò)義突變，來自丈夫，生物信息學(xué)軟件SIFT和Polyphen2預(yù)測(cè)該變異分別為有害的和很可能有害的變異(PP3)。而突變c.5601-8C＞T為非典型剪接區(qū)域變異，來自母親。該變異位于非典型的剪接區(qū)域，目前此變異對(duì)剪接過程的影響未知(圖2A、圖2B)。DPKHD1基因突變家系分析見圖2。

5 胎兒結(jié)局 給予充分的遺傳咨詢，夫妻及家屬最終選擇終止妊娠?；继ヒa(chǎn)后尸檢：左腎(LK)5.2 cm×3.5 cm×2.6 cm，形態(tài)規(guī)整，包膜完整，表面光滑；右腎(LK)3.8 cm×3.0 cm×2.2 cm，表面呈顆粒狀，腎包膜粘連致密，不易剝離(圖3A)；其他組織器官未見明顯異常。雙腎組織病理切片：左腎自溶較重，皮髓質(zhì)輪廓尚存，分界較清晰(圖3B)；右腎自溶嚴(yán)重，腎小球結(jié)構(gòu)模糊，皮髓質(zhì)分界不清(圖3C)。

圖2 胎兒PKHD1基因測(cè)序及CMA、測(cè)序家系圖 A：胎兒及丈夫檢測(cè)到PKHD1基因c.6794A＞T突變； B：胎兒及孕婦檢測(cè)到PKHD1基因c.5601-8C＞T突變(紅色箭頭所指處為突變位點(diǎn))； C：17q12微缺失綜合征家系圖； D：PKHD1基因突變家系圖Fig. 2 Fetal PKHD1 gene sequencing results and genetic analysis of the family A: PKHD1 c.6794A＞T mutation in the fetus and husband;B: PKHD1 c.5601-8C＞T mutation in the fetus and pregnant woman (red arrow showed the mutational locus); C: 17q12 microdeletion syndrome of genetic analysis of the family; D: PKHD1 mutations of genetic analysis of the family

圖3 胎兒腎大體觀及組織病理切片觀(×400) A：胎兒尸檢雙腎外觀； B：左腎病理切片； C：右腎病理切片F(xiàn)ig. 3 Gross appearance of the fetus kidney and pathological slices (×400) A: fetal kidneys' appearance; B: pathological slice of left kidney;C: microscopic image of right kidney tissue

討 論

當(dāng)腎回聲增強(qiáng)合并其他結(jié)構(gòu)異常時(shí)，先天性畸形的可能性顯著增大，應(yīng)考慮到某些遺傳綜合征和染色體微缺失微重復(fù)綜合征的可能[4]。Chaumoitre等[5]研究表明，當(dāng)腎回聲增強(qiáng)且腎臟體積增大，且不合并其他畸形時(shí)，提示可能與常染色體隱性或常染色體顯性多囊腎有關(guān)。Kumar等[6]發(fā)現(xiàn)單側(cè)腎異常預(yù)后較好，羊水過少合并腎以外畸形是低生存率的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。Tsatsaris等[7]發(fā)現(xiàn)，羊水量正常、腎(單側(cè)或雙側(cè))體積輕度增大(＜4SD)的胎兒存活率較高。本例中，在孕32周發(fā)現(xiàn)胎兒雙腎回聲增強(qiáng)，合并左腎增大、右腎多囊性變，而羊水量在正常范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)診至我院就診已孕33周，在產(chǎn)前診斷時(shí)限緊迫的情況下，臨床處理非常棘手，選擇快速準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷方法極其重要。

在孕婦及家屬充分知情同意情況下，我們行臍帶血穿刺送檢胎兒臍血生化、CMA、核型分析及全外顯子組測(cè)序。胎兒SNP array結(jié)果回報(bào) 17q12(34，822，465-36，350，028)×1， 即 在17號(hào)染色體17q12區(qū)段存在1.5 Mb片段的缺失，內(nèi) 含 HNF1-β(189907)，PIGW(610275)等 17個(gè)OMIM基因，覆蓋含17q12微缺失綜合征致病區(qū)域。核型結(jié)果46，XN，提示為正常核型。

17q12微缺失綜合征(OMIM：614527)與腎病和神經(jīng)發(fā)育缺陷密切相關(guān)[8-10]，是已知的第三個(gè)引起顯著腎損害的遺傳性疾病[11]。17q12微缺失綜合征具有廣泛的臨床表型譜，癥狀包括腎病變、胰腺發(fā)育不良、言語及學(xué)習(xí)障礙、癲癇、自閉癥、精神分裂癥、腦結(jié)構(gòu)異常、運(yùn)動(dòng)發(fā)育滯后、斜視、關(guān)節(jié)松弛、十二指腸閉鎖、先天性膈疝、早產(chǎn)等。其中，以腎及泌尿道結(jié)構(gòu)異常、青少年發(fā)病的成人型糖尿病和神經(jīng)精神類疾病為典型臨床表現(xiàn)[12]。在胎兒期，Jones等[13]發(fā)現(xiàn)，17q12微缺失綜合征最常見的B超表現(xiàn)是回聲增強(qiáng)、多囊腎或腎體積增大。

17q12微缺失綜合征為常染色體顯性疾病，Rasmussen等[14]總結(jié)丹麥國內(nèi)17q12微缺失綜合征患者，發(fā)現(xiàn)77%(36/47)為新發(fā)突變，23%(9/47)為家系遺傳而來。故夫妻雙方應(yīng)行CMA檢測(cè)，以明確此缺失是否遺傳于其中一方。本例孕婦測(cè)序結(jié)果顯示在17q12區(qū)域存在約1.5Mb片段缺失，提示胎兒17號(hào)染色體缺失區(qū)段遺傳于孕婦本人。對(duì)17q12微缺失綜合征成人患者，應(yīng)行相應(yīng)檢查明確綜合征相關(guān)疾病存在與否及嚴(yán)重程度。本例孕婦認(rèn)知學(xué)習(xí)情況良好，腎功能檢查未見異常，無糖尿病相關(guān)癥狀等表現(xiàn)。

17q12微缺失綜合征的表型譜廣泛且表現(xiàn)度差異性大，17q12微缺失綜合征胎兒的預(yù)后不明確，對(duì)遺傳咨詢工作造成極大困難。本例患兒缺失片段雖遺傳于孕婦，但據(jù)Rasmussen等[14]報(bào)道，在同一家庭中患者的表型差異性較大，可能存在遺傳修飾因子或環(huán)境因素發(fā)揮作用。目前胎兒期腎功能的判斷多以羊水量減少來推斷，B超提示羊水量尚在正常范圍，而臍血生化提示腎功能已輕度受損，對(duì)預(yù)后判斷和臨床決策起到了重要作用。

全外分析提示患胎存在PKHD1基因c.6794A＞T(p.His2265Leu)和c.5601-8C＞T復(fù)合雜合突變，前者為錯(cuò)義突變(父源)，后者為非典型剪接區(qū)域變異(母源)。PKHD1基因是已知的常染色體隱性遺傳的多囊腎和肝病(OMIM 263200)的致病基因，目前尚無該基因位點(diǎn)復(fù)合雜合突變致病性報(bào)告。SIFT和Polyphen2軟件預(yù)測(cè)c.6794A＞T變異分別為有害的和很可能有害的，c.5601-8C＞T變異對(duì)剪接過程的影響未知。推測(cè)該例胎兒臨床表型較孕婦嚴(yán)重的原因與攜帶PKHD1基因的復(fù)合雜合突變有關(guān)，尚需進(jìn)一步行基因功能驗(yàn)證。

因此，對(duì)孕晚期發(fā)現(xiàn)的腎回聲增強(qiáng)病例，應(yīng)用臍血生化檢驗(yàn)評(píng)估胎兒腎功能情況，判斷胎兒預(yù)后情況。行CMA及WES檢測(cè)，綜合分析致病原因，單獨(dú)一種檢測(cè)手段可能漏診致病原因，需引起重視。17q12微缺失綜合征是腎回聲增強(qiáng)病因之一，同時(shí)行家系篩查以明確是否為遺傳所致。PKHD1基因的復(fù)合雜合突變可能為患胎表型嚴(yán)重的原因，需進(jìn)一步行基因功能驗(yàn)證以明確。