張 倩，顧成磊，葉明俠，張 哲，孟元光

解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)被定義為子宮內(nèi)膜的腺體、間質(zhì)異位到子宮腔以外部位生長、浸潤，是最常見的婦科良性增殖性疾病，影響著6% ～ 10%的育齡期女性，其中存在慢性盆腔痛和(或)不孕的女性占35% ～ 50%，嚴重影響著女性健康[1]。EM的確切病因尚不明確，但有研究表明增殖與凋亡的分子調(diào)節(jié)異常是其發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性小分子RNA，不參與蛋白質(zhì)的編碼，主要通過與mRNA的3'UTR(Untranslated Region)結(jié)合降解靶mRNA控制人類的蛋白編碼基因。已有大量的研究表明，microRNAs在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的多個環(huán)節(jié)中起重要的作用。在之前的實驗中，我們采用高通量測序的方法在EM患者在位內(nèi)膜(eutopic endometrial，Eu)及異位內(nèi)膜(ectopic endometrial，Ec)中篩選出一系列差異表達的microRNAs， 其 中 miR-20b-5p、miR-106a-5p在異位病灶中顯著下調(diào)，提示可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病[3]。miR-20b、miR-106a是miR-106a-363基因簇中的成員，兩者結(jié)構(gòu)相似，功能相近[4]。據(jù)報道，兩者均有促進腫瘤細胞增殖效應(yīng)[5-6]。PTEN不僅是重要的腫瘤抑制基因[7]，其突變或表達缺失也與EM的發(fā)生密切相關(guān)[1]，其高表達可作為細胞凋亡的標記物。細胞周期蛋白E1(cyclin E1，CCNE1)是細胞周期調(diào)節(jié)的重要因子，過表達將使細胞處于異常增殖狀態(tài)，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[8]，CCNE1可以作為細胞增殖的獨立預(yù)測標志。本實驗擬研究miR-106a-5p與miR-20b-5p對子宮內(nèi)膜異位癥細胞增殖與凋亡的影響，我們分別檢測了細胞增殖標記CCNE1和腫瘤抑制標記PTEN，并分析它們的相關(guān)性。

對象和方法

1 研究對象 選擇2017年5月- 2018年5月在本院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)及術(shù)后病理檢查確診的EM患者30例，年齡(32.4±6.2)歲，采用美國生育學(xué)會修訂的EM分期標準(r-AFS)進行分期：Ⅰ/Ⅱ期患者3例(月經(jīng)周期：1例增殖期，2例分泌期)，Ⅲ/Ⅳ期患者27例(月經(jīng)周期：7例增殖期，20例分泌期)。對照組選擇同期行腹腔鏡子宮肌瘤剔除術(shù)的患者30例，年齡(36.35±5.89)歲。兩組患者年齡無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。所選患者均月經(jīng)規(guī)律，排除其他內(nèi)外科合并疾病，術(shù)前3個月內(nèi)無內(nèi)分泌藥物治療，術(shù)前6個月內(nèi)無哺乳史。本研究通過院倫理委員會審查并批準，所有入組患者均知情同意。

2 研究方法 獲取正常子宮內(nèi)膜30例、在位子宮內(nèi)膜30例及異位子宮內(nèi)膜組織37例，分別檢測 miR-106a-5p、miR-20b-5p、CCNE1、PTEN 的表達，探討它們在內(nèi)異癥內(nèi)膜組織中的表達模式及rAFS和內(nèi)膜周期對它們表達的影響，同時研究miR-20b-5p、miR-106a-5p對子宮內(nèi)膜異位癥細胞增殖與凋亡的影響。

3 實驗方法 1)標本的獲取：無菌操作下，從30例EM患者中獲得37例內(nèi)異癥異位內(nèi)膜組織(其中1例為雙側(cè)卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，4例合并腹膜EM，2例合并深部浸潤型EM，故不同病灶分別取材)，標本離體后立即取1 cm2大小組織，凍存于液氮。2)總RNA的提取及mRNA的qRT-PCR：用TRIzol(美國invitrogen)試劑提取組織總RNA，用NanoDrop微量分光光度計(美國Thermo)檢測總RNA質(zhì)量，OD260/OD280=1.8-2.0、OD260/OD230＞2.0為合格樣品。將合格總RNA逆轉(zhuǎn)錄，使用cDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(美國Thermo)進行，熒光實時定量PCR反應(yīng)用qPCR預(yù)混試劑(日本TOYOBO)進行，實驗步驟均按照相關(guān)試劑說明書嚴格進行。PTEN、CCNE1擴增引物序列參見文獻[9]，以β-actin為內(nèi)參。擴增條件：95℃1 min 1個循環(huán)，94℃15 s、60℃30 s、72℃40 s 45個循環(huán)。3)miRNA的qRT-PCR：采用莖環(huán)特異性引物法進行逆轉(zhuǎn)錄[10]，其他步驟同mRNA。莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物序列：miR-20b-5p，GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC GACCTACCTG；miR-106a-5p，GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACG ATGGAC。得到cDNA模板，對cDNA模板進行qPCR反應(yīng)。引物序列，miR-20b-5p上游：5'-GCTGCAAAGTGCTCATAGTG-3'，miR-106a-5p上游：5'-CGTGACAAAAGTGCTTACAGTG，下游通用引物序列：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。以U6為內(nèi)參。擴增反應(yīng)條件：95℃1 min 1個循環(huán)，94℃15 s、55℃30 s、72℃40 s 45個循環(huán)；每個樣本重復(fù)3次。表達水平采用相對定量2-△△CT方法計算得出。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗，不滿足正態(tài)分布的資料應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗及Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較結(jié)果采用調(diào)整顯著性后的P值。滿足正態(tài)性的采用t檢驗及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。MiR-106a-5p、miR-20b-5p與PTEN、CCNE1表達水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05 (雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三組組織標本中相關(guān)指標比較 Ec與Eu相比，miR-20b-5p(0.26±0.24 vs 0.92±0.40)、miR-106a-5p(0.78±0.37 vs 1.79±0.68)表達量均顯著下降(P均＜0.001)；PTEN mRNA(2.34±1.27 vs 0.92±0.35)的表達量顯著上升(P＜0.001)；CCNE1 mRNA(0.78±0.35 vs 1.12±0.44)的表達量顯著下降(P=0.005)；Eu與N相比，miR-20b-5p(0.92±0.40 vs 0.56±0.23)表達量顯著上升(P=0.038)；PTEN(0.92±0.35 vs 1.28±0.36)表達量顯著下降(P=0.049)，miR-106a-5p(1.79±0.68 vs 1.33±0.52)及 CCNE1(1.12±0.44 vs 1.35±0.53)的表達未見明顯差異(P＞0.05)。見圖1。

2 異位內(nèi)膜組織標本中rAFS分期、內(nèi)膜周期對相關(guān)指標表達的影響 異位內(nèi)膜組織標本中，未發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p、miR-106a-5p、PTEN、CCNE1的表達在不同rAFS分期及不同內(nèi)膜周期中存在統(tǒng)計學(xué)差異(P均＞0.05)。見表1和表2。

圖1 MiR-20b-5p、 miR-106a-5p、 PTEN、 CCNE1在三組表達的比較Fig. 1 Comparison of expression levels of miR-20b-5p, miR-106a-5p, PTEN, CCNE1 in three groups

3 MiR-20b-5p、miR-106a-5p與PTEN表達水平的相關(guān)性 MiR-20b-5p與PTEN mRNA在在位內(nèi)膜(r=-0.63，P＜0.001)及異位內(nèi)膜(r=-0.42，P=0.01)中的表達均呈負相關(guān)；miR-106a-5p與PTEN mRNA的表達在在位內(nèi)膜(r=-0.14，P=0.465)及異位內(nèi)膜(r=-0.25，P=0.142)中均不存在相關(guān)性。

表1 不同rAFS分期異位內(nèi)膜中microRNA和mRNA的表達Tab. 1 Expression of microRNA and mRNA in Ec group for different rAFS

表2 不同內(nèi)膜周期患者異位內(nèi)膜中 microRNA和mRNA的表達Tab. 2 Expression of microRNA and mRNA in Ec group for different menstrual cycle

討 論

已有證據(jù)表明子宮內(nèi)膜異位癥中大量miRNAs存在差異表達，其中包括miR-183、miR-200b、miR451、miR-29c、miR-196、miR-23 等[11-14]。它們參與調(diào)節(jié)內(nèi)異癥的細胞生長、黏附、侵襲、遷移及凋亡等生物學(xué)過程[15]。成熟體序列miR-20b-5p位于性染色體Xq26.2，該區(qū)域為染色體脆性區(qū)域，其突變與人類多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[5]。miR-106a-5p與miR-20b-5p同屬miR-106a-363基因簇中的成員，已被證實在多種腫瘤性疾病中存在差異表達[6,16]。有研究表明miR-106a-5p是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)節(jié)子，其過表達能上調(diào)FAS凋亡途徑[17]。然而，二者在EM發(fā)生中的作用尚不得知。

本研究發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜相比，PTEN mRNA的表達升高，CCNE1的表達降低。分析原因可能是EM是一種逐步進展的疾病，早期異位病灶中細胞增殖活力增強，晚期異位病灶組織發(fā)生反復(fù)出血，導(dǎo)致壓迫及壞死，病灶組織纖維化，細胞增殖活力減弱，而本實驗中選取病例多數(shù)屬于晚期。

本研究還發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜組織較在位內(nèi)膜miR-20b-5p的表達減少，PTEN mRNA的表達增加；在位內(nèi)膜組織較正常內(nèi)膜miR-20b-5p的表達增加，PTEN mRNA的表達減少，且miR-20b-5p與PTEN mRNA的表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示在位內(nèi)膜有更強的增殖能力，而凋亡能力減弱，這有利于子宮內(nèi)膜的異位存活。有文獻報道PTEN mRNA是miR-20b-5p的靶基因之一，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達且miR-20b-5p能夠明顯促進前列腺癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[5,18]。上述結(jié)果均表明miR-20b-5p可能通過調(diào)節(jié)PTEN的表達，影響細胞增殖，從而在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

有研究表明，PTEN是miR-106a-5p的直接靶基因。而本研究中，異位內(nèi)膜組織較在位內(nèi)膜組織miR-106a-5p的表達量明顯下降，PTEN的表達升高，但未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在明顯的相關(guān)性。miR-106a-5p在EM中的具體作用機制有待進一步驗證。

綜上，異位內(nèi)膜較在位內(nèi)膜miR-20b-5p和miR-106a-5p表達明顯下降，在位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜miR-20b-5p表達明顯升高、miR-106a-5p的表達無明顯差異。在異位及在位組織中miR-20b-5p與PTEN的表達呈負相關(guān)關(guān)系。提示miR-20b-5p可能通過PTEN上調(diào)細胞增殖，促進EM的發(fā)病。miR-20b-5p可能成為EM潛在治療位點。