喬美玲，劉漢雄，樊鳳嬌，涂茂林，于翠平，杜 明,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

貽貝（Mytilus）屬軟體動(dòng)物門(mén)，瓣鰓綱，異柱目，貽貝族，貽貝科，俗稱(chēng)“海紅”（北方）、“淡菜”（干品）等，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“海中雞蛋”的美稱(chēng)，是人們喜愛(ài)的海產(chǎn)貝類(lèi)，也是我國(guó)沿海常見(jiàn)的一種海鮮產(chǎn)品，在我國(guó)山東、浙江、遼寧和福建等沿海省份養(yǎng)殖海域廣闊，主要品種為紫貽貝（M. edulis）和厚殼貽貝（M. crassitesta Lischke）。養(yǎng)殖貽貝生長(zhǎng)快，純天然，無(wú)污染，品質(zhì)好，產(chǎn)量大[1]。根據(jù)2016年和2017年檢數(shù)據(jù)表明，貽貝的產(chǎn)量在2015年和2016年分別為84.5萬(wàn) t和87.9萬(wàn) t。目前，貽貝加工除了少量加工成凍品、罐頭和干品外，大都以活鮮品銷(xiāo)售，產(chǎn)品較為單一，嚴(yán)重影響了貽貝資源的高效利用。近年來(lái)，研究人員對(duì)海洋生物尤其是貝類(lèi)活性成分的研究已取得一定成果，加工企業(yè)也利用這些研究成果成功開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的海洋功能食品，如牛磺酸[2]、蛋白功能食品[3]、海洋多糖[4]和多不飽和脂肪酸[5]等產(chǎn)品，并獲得了相當(dāng)好的經(jīng)濟(jì)效益。我國(guó)現(xiàn)有的相關(guān)研究主要集中在貽貝的形態(tài)、分類(lèi)、初級(jí)加工和捕撈養(yǎng)殖等方面，國(guó)外則主要集中在貽貝的毒素[6]等方面，鮮有報(bào)道關(guān)于貽貝鹽溶性蛋白酶酶解產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性的研究[7]。因此，本研究以貽貝為原料，提取貽貝的鹽溶性蛋白，并對(duì)其分子質(zhì)量分布、粒度分布和熱變溫度進(jìn)行分析，通過(guò)3 種蛋白酶酶解蛋白，評(píng)價(jià)酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性。用質(zhì)譜鑒定多肽的氨基酸序列，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)中打分分?jǐn)?shù)、關(guān)鍵氨基酸作用位點(diǎn)和氫鍵等相互作用篩選抑制活性最高的多肽，探討其發(fā)揮活性的機(jī)理，從而為充分利用貽貝資源，開(kāi)發(fā)具有ACE抑制活性的貽貝多肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝采購(gòu)于遼寧省大連市新長(zhǎng)興市場(chǎng)，活體運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

ACE、胰酶、三氟乙酸（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；胰蛋白酶 美國(guó)Ameresco生物試劑公司；中性蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇 美國(guó)Spectrum化學(xué)試劑公司；甲酸 阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T25勻漿機(jī) 艾卡儀器設(shè)備有限公司；CF16RXII離心機(jī) 日立有限公司；5KDN-103F自動(dòng)定氮儀、二十孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；BSA1245萬(wàn)分之一天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；μ-DSC微量熱儀 法國(guó)塞塔拉姆儀器公司；1260高效液相色譜儀安捷倫科技有限公司；HSE-12B固相萃取儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；TTL-DC型多功能氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；IMPCT反向高效液相超高解析度四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀 布魯克科技有限公司；Zetasizer 3000HSA激光粒度儀 英國(guó)Malvern儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 貽貝鹽溶性蛋白的制備

將新鮮的貽貝洗凈，剝殼，去足絲。瀝干多余水分，剪碎，8 000 r/min勻漿。按照料液比1∶3（g/mL）加入0.05 mol/L pH 7的磷酸緩沖溶液，于4 ℃磁力攪拌30 min，8 000 r/min離心去除上清液，重復(fù)2 次，沉淀物按照料液比1∶3加入0.1 mol/L pH 7的含有2 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液，8 000 r/min離心得到的上清液即為貽貝鹽溶性蛋白[8-10]。

1.3.2 貽貝鹽溶性蛋白的特性分析

參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第1法測(cè)定粗蛋白含量；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）測(cè)定蛋白分子質(zhì)量分布；激光粒度儀測(cè)定蛋白粒度分布；μ-DSC微量熱儀測(cè)定蛋白熱變性溫度。

1.3.3 貽貝鹽溶性蛋白酶解液的制備

分別采用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶對(duì)貽貝鹽溶性蛋白進(jìn)行酶解。參考文獻(xiàn)[11-13]并適當(dāng)修改，確定條件分別為：溫度45 ℃，pH 8.5，時(shí)間3 h，2 g/100 mL蛋白溶液；溫度50 ℃，pH 7.0，時(shí)間4 h，2 g/100 mL蛋白溶液；溫度40 ℃，pH 8.0，時(shí)間4 h，2 g/100 mL蛋白溶液；待pH值、溫度條件到達(dá)后，按照5 000 U/g加入相應(yīng)的酶，分別進(jìn)行酶解。沸水浴15 min滅酶，冷卻至室溫后，8 000 r/min離心取上清液，真空冷凍干燥制備得到酶解多肽粉。酶解液的分子質(zhì)量分布測(cè)定采用孫娜等[14]的方法。

1.3.4 貽貝鹽溶性蛋白酶解液ACE抑制活性測(cè)定

貽貝多肽ACE抑制率的測(cè)定參考賈夢(mèng)蛟等[15]的方法，并作適當(dāng)修改。取50 μL 5 mmol/L馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）與20 μL的樣品混合，于37 ℃恒溫水浴5 min，加入20 μL 0.1 U/mL ACE溶液，充分混合，37 ℃恒溫水浴60 min后，反應(yīng)分解產(chǎn)生馬尿酸，加入20 μL 2 mol/L HCl溶液中止反應(yīng)，離心取上清液，加入進(jìn)樣瓶中，波長(zhǎng)228 nm處進(jìn)行檢測(cè)。樣品用pH 8.3、含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖溶液配制成6 種不同的質(zhì)量濃度，測(cè)定活性半抑制濃度（IC50），空白為硼酸緩沖溶液。繪制濃度-抑制率曲線，得到回歸方程，通過(guò)曲線方程計(jì)算抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度值，即IC50值[16]。ACE抑制率計(jì)算如下所示：

1.3.5 酶解液多肽的前處理及質(zhì)譜鑒定

酶解液通過(guò)C18小柱除去大蛋白和鹽分。首先把小柱安裝在固相萃取儀中，用真空泵保證其真空狀態(tài)，用1 mL甲醇沖洗3 次，0.1%甲酸溶液沖洗3 次，每次1 mL，完成柱子的活化。然后加入1 mL樣品，多肽附著在柱子上，用0.1%甲酸溶液沖洗3 次，達(dá)到除去大蛋白和除鹽的目的。最后用80%甲醇溶液分3 次，每次500 μL收集多肽溶液。用氮?dú)獯蹈扇芤海玫焦腆w多肽備用[17]。

樣品上質(zhì)譜前用0.1%的甲酸溶液復(fù)溶，并用1%的甲酸溶液調(diào)節(jié)pH 2～3。色譜條件為：色譜柱C18（150 mm×3 mm，3 μm，100 ?）；上樣量：10 μL；流動(dòng)相：水相為0.1%甲酸溶液，有機(jī)相為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫條件：流速0.4 mL/min，0～10 min為10%有機(jī)相和90%水相，10～15 min為35%有機(jī)相和65%水相，15～30 min為50%有機(jī)相和50%水相，30～32 min為80%有機(jī)相和10%水相，32～40 min為10%有機(jī)相和90%水相[17-18]。串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)MASCOT搜庫(kù)，選擇雙殼綱庫(kù)與貽貝庫(kù)（2017年3月下載于NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）檢測(cè)參數(shù)設(shè)置為：前體離子誤差10-6，子離子誤差1 u，允許2 個(gè)位點(diǎn)誤切，假陽(yáng)性率≤1%，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物設(shè)置固定的酶切位點(diǎn)，其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義（P＜0.05）被認(rèn)定為有效的鑒定結(jié)果[19]。

1.3.6 多肽分子對(duì)接及機(jī)理分析

ACE廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中并對(duì)血壓起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。ACE抑制肽通過(guò)抑制ACE來(lái)達(dá)到降血壓的作用[20]，所以多肽與ACE的相互作用效果可以表征降血壓活性的強(qiáng)弱。本研究采用分子對(duì)接技術(shù)，模擬多肽與ACE相互作用，具體操作如下：用DS中的Build and edit protein工具輸入鑒定出的多肽序列，并在Minimize Ligands中優(yōu)化多肽結(jié)構(gòu)，多肽命名為對(duì)接配體。另一方面連接網(wǎng)絡(luò)從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中找到并打開(kāi)所需要的蛋白1O86（圖1），在Prepare protein中優(yōu)化蛋白結(jié)構(gòu)，主要包括去水加氫、補(bǔ)全丟失的氨基酸等，并將蛋白定義為對(duì)接受體。選擇CDDOCK程序?qū)⑴潴w對(duì)接到受體中去，根據(jù)所得結(jié)果中-CDOCKER Energy值，完成ACE抑制活性多肽的初步篩選[16,20]，之后結(jié)合多肽氨基酸的組成特點(diǎn)及相互作用力進(jìn)一步篩選出較優(yōu)的多肽構(gòu)像，即進(jìn)一步完成活性較高多肽的篩選。

圖1 分子對(duì)接蛋白受體1O86Fig. 1 Molecular docking protein receptor 1O86

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝鹽溶性蛋白基本性質(zhì)

圖2 貽貝鹽溶性蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE of salt-soluble protein from Mytilus edulis

由圖2可知，貽貝鹽溶性蛋白主要分布在200～250、97.2～116 kDa和小于43 kDa三部分，其所對(duì)應(yīng)的蛋白種類(lèi)主要為肌球蛋白重鏈、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白。鹽溶性蛋白中副肌球蛋白，即泳道中顏色較深、分布在100 kDa附近的條帶，所占比例較大，結(jié)果與某些魚(yú)類(lèi)和文蛤鹽溶性蛋白的電泳條帶分布情況基本相似[21]。

圖3 貽貝鹽溶性蛋白粒度分析Fig. 3 Particle size analysis of salt-soluble protein from Mytilus edulis

圖4 貽貝鹽溶性蛋白熱變性溫度的測(cè)定Fig. 4 Thermal denaturation temperature of salt-soluble protein

由圖3可知，蛋白的粒徑主要分布在兩大部分，一部分為350～700 nm，另一部分為1 400～2 800 nm左右，平均粒徑為572.3 nm，比魚(yú)類(lèi)蛋白平均粒徑大100～250 nm[22-23]，這可能與鹽溶性蛋白中不同種蛋白的比例有一定的關(guān)系。鹽溶性蛋白中的肌球蛋白的變性溫度在40～60 ℃之間，是熱穩(wěn)定性較差的蛋白質(zhì)[24]，而同樣身為鹽溶性蛋白的肌動(dòng)蛋白是熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，其開(kāi)始變性的溫度為71 ℃[25]，由圖4可知，貽貝鹽溶性蛋白的熱變性溫度是46.5 ℃，比文獻(xiàn)報(bào)道[26]的41.7 ℃略高，原因可能是貽貝肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白比例比魚(yú)的較高，所以導(dǎo)致蛋白整體的變性溫度變高。

2.2 貽貝鹽溶性蛋白酶解液中多肽分子質(zhì)量分布

圖5 3 種酶解液中多肽分子質(zhì)量分布情況Fig. 5 Molecular mass distribution patterns of three hydrolysates

如圖5所示，整體來(lái)說(shuō)，分子質(zhì)量大于5 kDa的比例較小，結(jié)合SDS-PAGE數(shù)據(jù)可知，肌原纖維蛋白大都在40 kDa以上，所以3 種酶的酶解條件的選擇都較為合適，最終的酶解效果較為理想。其中分子質(zhì)量在0.5～3 kDa的區(qū)間，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物多肽所占比例較大，大概為47%，顯著高于其他兩種酶解產(chǎn)物，可能原因是胰蛋白酶具有特定的酶切位點(diǎn)，使得蛋白酶解產(chǎn)物較為單一，使得分布在該區(qū)域的多肽較多，比例較高。另一方面，在各自酶的最適條件下的3 種水解度分別為：11.75%、9.93%和22.16%。胰酶酶解產(chǎn)物的水解度顯著高于其他兩種，原因可能是因?yàn)橐让甘且环N混合酶，多種酶一起發(fā)揮作用，使得水解度較高。

2.3 酶解物ACE抑制活性測(cè)定結(jié)果

圖6 3 種酶解液的ACE抑制活性Fig. 6 ACE inhibitory activities of the three hydrolysates

從圖6可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，抑制率都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)竭_(dá)某一質(zhì)量濃度時(shí)，趨于平緩，符合一般活性趨勢(shì)。但是，當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.75 mg/mL時(shí)，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑制率始終大于其他兩個(gè)樣品，當(dāng)大于0.75 mg/mL之后，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物與中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑制率基本相同，并且趨于平緩。胰酶酶解產(chǎn)物在0.5～1.0 mg/mL時(shí)，抑制率趨于平緩，為48%左右。3 種酶解產(chǎn)物的擬合方程為：y=16.26+177.32x-97.61x2；y=4.47+167.05x-79.37x2；y=1.73+104.27x-44.79x2。IC50值分別為215.96、321.75、637.67 μg/mL，比付金霞[27]、郝記明[28]等的1.74、1.32 mg/mL結(jié)果顯著較低，故具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.4 多肽序列的鑒定及活性機(jī)理

表1 胰蛋白酶酶解多肽能量值及與ACE作用的氨基酸Table 1 －CDOCHER energy of peptides from tryptic hydrolysate and amino acid residues bound to ACE

通過(guò)質(zhì)譜分析，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到了1 600多條多肽序列。Lim等[29]報(bào)道小分子質(zhì)量的多肽因?yàn)檫m應(yīng)ACE的結(jié)合位點(diǎn)，所以其具有較高的活性，所以本研究挑選出不大于10 個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行分子對(duì)接模擬，最終根據(jù)-CDOCKER Energy值的大小，初步篩選出180 分以上的多肽序列（11 條）進(jìn)行下一步的分析。這些多肽序列為：GQLEISNVR、ELEDSLDSER、WIAEEADK、ADFESQIK、LEEAEAQALK、IFDAIEK、VEFLDDSNR、LYDIDVAK、SLLEHAER、AAVDDLTR、ISMLEEDIMK（表1），根據(jù)它們的分值及與多肽作用的ACE上的氨基酸，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[30]的查閱可初步確定的活性部位氨基酸殘基為His353-Ala354-Ser355-Ala356-Val380-His38-Glu384-His387-Glu411-Lys511-Phe512-His513-Val518-Tyr520-Arg522-Tyr523，11 個(gè)多肽結(jié)合的氨基酸個(gè)數(shù)分別為18、19、19、16、16、16、21、22、18、16、20，其中關(guān)鍵的氨基酸數(shù)目分別為11、8、10、8、6、8、10、10、8、9、10，GQLEISNVR是11 個(gè)多肽中結(jié)合關(guān)鍵氨基酸數(shù)目最多的，這可能就是它分值最高的部分原因。同時(shí)氫鍵個(gè)數(shù)的分布與-CDOCKER Energy的分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯的線性關(guān)系，推測(cè)可能與其他的相互作用有一定的關(guān)系。

圖7 多肽與ACE的相互作用Fig. 7 Interaction between peptides and ACE

由于ACE的C端結(jié)構(gòu)域是疏水環(huán)境，所以抑制活性肽中疏水性氨基酸的含量，決定其是否具有較高的ACE抑制活性。疏水性氨基酸的數(shù)量及其在肽鏈上的位置則直接影響了多肽的空間結(jié)構(gòu)的形成[31]。研究表明，N端為疏水性氨基酸或堿性氨基酸（除脯氨酸外），與ACE親和力較強(qiáng)，抑制活性較高。WIAEEADK、ADFESQIK、LEEAEAQALK、IFDAIEK、VEFLDDSNR、LYDIDVAK、AAVDDLTR和ISMLEEDIMK這8 個(gè)多肽的N端氨基酸為疏水性氨基酸，WIAEEADK、IFDAIEK和LYDIDVAK含有4 個(gè)疏水性氨基酸；LEEAEAQALK和ISMLEEDIMK含有5 個(gè)疏水性氨基酸，含量較高，故推測(cè)其活性可能較高[32]。另一方面，氫鍵作用是分子間較強(qiáng)的作用力，對(duì)兩分子間的相互作用有著極其重要的作用，已有研究[33-35]表明，多肽與ACE的相互作用模式以氫鍵作用為主，故本研究也對(duì)初篩的11 個(gè)多肽進(jìn)行氫鍵數(shù)量及其位置的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果分別為10、13、12、7、11、12、13、16、10、15、10，氫鍵位置為表1中加粗字體標(biāo)識(shí)（圖7綠線），有的氨基酸比如Ala354等可能具有2 個(gè)或者多個(gè)氫鍵，所以加粗氨基酸個(gè)數(shù)可能小于氫鍵個(gè)數(shù)，其中各多肽的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合的氫鍵數(shù)目分別為5、2、7、4、3、9、6、9、5、6和5。同時(shí)由圖7也可證明：綠色標(biāo)識(shí)的氫鍵在多肽與ACE相互作用中占主導(dǎo)地位，其次還有碳?xì)滏I作用和親疏水作用等，這些作用共同維持了多肽與ACE間的結(jié)合，保證多肽發(fā)揮活性作用。故綜上所述，LYDIDVAK和WIAEEADK確定為ACE抑制活性較強(qiáng)的多肽。

3 結(jié) 論

貽貝鹽溶性蛋白分子質(zhì)量主要分布在40～250 kDa之間，蛋白平均粒徑為572.3 nm，熱變性溫度為46.5 ℃。3 種蛋白酶酶解液中，胰蛋白酶酶解物IC50值最低，為215.96 μg/mL，ACE抑制活性較高。通過(guò)質(zhì)譜鑒定得到胰蛋白酶酶解多肽序列，同時(shí)利用分子對(duì)接技術(shù)，推測(cè)多肽與ACE蛋白的結(jié)合情況。通過(guò)分析關(guān)鍵氨基酸、疏水性氨基酸和氫鍵結(jié)合等情況，最終推斷出多肽LYDIDVAK和WIAEEADK活性較高，有望成為血管緊張素酶抑制肽。同時(shí)建立了一種快速，準(zhǔn)確篩選貽貝鹽溶性蛋白酶解物中活性多肽的方法，為貽貝產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。