閆競宇, 丁俊杰, 金高娃, 郭志謀, 梁鑫淼

中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室, 遼寧 大連 116023

糖是一類重要的生命活性物質，它不僅是細胞能量代謝的源泉，還常作為信號分子參與細胞的各種活動，例如分子識別、信號傳導和免疫等過程。近年來，人體來源的低聚糖由于與人體健康息息相關而引起科研工作者的關注，從人體來源的龐大糖庫中尋找有益的寡糖已經成為功能性寡糖研究的主要方向之一。在人源性寡糖中，來源于人乳中的低聚糖——人乳寡糖，由于其含量高、種類豐富并且與嬰幼兒的生長發(fā)育息息相關而引起人們的重視。

人乳作為嬰兒出生時唯一的食物來源，一方面其幾乎含有嬰兒必須的所有營養(yǎng)物質，如蛋白質、脂肪、碳水化合物以及微量的礦物質元素和維生素等，另一方面人乳對嬰兒完善免疫系統(tǒng)、生長發(fā)育等方面具有重要的作用，而這些功能的實現(xiàn)與人乳中的寡糖組分密切相關[1～3]。人乳寡糖是人乳區(qū)別于其他哺乳動物乳汁的最主要成分，主要表現(xiàn)在：①人乳寡糖在乳汁中的含量是哺乳動物中含量最高的。1 L人乳中約含有5～20 g人乳寡糖，尤其在初乳中含量更高，1 L初乳中人乳寡糖可以達到20～25 g。而其他哺乳動物的乳汁相比較之下寡糖含量要低上百倍，例如在1 L牛奶中寡糖含量僅為0.03～0.06 g，山羊奶中寡糖含量為0.25～0.30 g，綿羊奶中僅含有0.02～0.04 g[4]。②人乳寡糖結構種類最多。豐富的種類也是人乳寡糖區(qū)別于其他哺乳類動物乳汁的重要特征。據(jù)預測人乳寡糖的種類可達到數(shù)百種，2010年日本學者Kobata[5]綜述了近百種已發(fā)現(xiàn)的人乳寡糖結構，而目前所報道的牛乳、羊乳中寡糖僅有數(shù)十種[6]。③人乳寡糖結構組成同其他哺乳動物也有較大差異。人乳寡糖結構由5個基本糖單元組成，即葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、巖藻糖(Fuc)和唾液酸(N-乙酰神經氨酸-Neu5Ac)。這些寡糖一般在還原末端有一個乳糖，在乳糖的非還原端被不同數(shù)量的Galβ1-3GlcNAc (TypeⅠ) 或Galβ1-4GlcNAc (TypeⅡ) 單元分別以β1-3或β1-6方式延長成直鏈或支鏈寡糖結構(圖1,彩圖見圖版一)。尤其值得注意的是人乳中所含有的唾液酸化寡糖組成是Neu5Ac，而其他哺乳動物的乳汁中如牛奶、羊奶中含有人體外源性的N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)，且人乳中巖藻糖化寡糖和唾液酸的量要遠遠高于其他哺乳類動物。正是由于人乳寡糖的差異性存在，使人乳變得非常“特別”，也使人乳成為嬰兒配方奶粉不能企及的“黃金標準”。

圖1 人乳寡糖結構示意圖Fig.1 Schematic illustration of compositions and structures of HMOs.(彩圖見圖版一)

與牛乳和其他哺乳動物的乳汁相比，人乳寡糖的高含量和結構的多樣性賦予了其一些特殊的生物學功能[7～9]。其中，人乳寡糖最為人熟知的功能是作為益生元調節(jié)嬰兒腸道菌群。大多數(shù)的人乳寡糖不會被嬰兒消化道消化，幾乎全部以原型形式抵達小腸和結腸，在那里被某些益生菌如一些雙歧桿菌所利用，從而促進這些益生菌的生長，同時人乳寡糖被腸道菌群利用代謝后，產生短鏈的脂肪酸，可降低嬰兒腸道內的pH，抑制了致病菌如梭狀芽胞桿菌、埃希氏大腸桿菌等的繁殖，進而維持腸道的微生態(tài)平衡，保護嬰兒腸道健康。人乳寡糖另外一個重要的功能就是通過抗微生物黏附進而改善機體的防御功能。病毒、細菌等病原體侵入人體時首先要和宿主結合，最常見的方式為黏附上皮細胞表面受體，這些與病原體結合的受體多為糖復合物例如糖蛋白或者糖脂上的糖鏈，而人乳寡糖中的糖與這些受體在結構上非常相似，可以作為水溶性受體“引誘”病原體或致病菌與其結合從而被排出體外，實現(xiàn)了對機體的保護作用。例如含有1,2-巖藻糖的寡糖可以阻斷空腸彎曲桿菌的黏附，也能中和大腸桿菌產生的耐熱內毒素，從而降低這些因素引發(fā)的嬰兒腹瀉。

隨著對人乳以及糖生物學研究的深入，人乳中糖類成分的功能逐漸被重視和發(fā)現(xiàn)，但想要進一步揭示其生物學功能，首先需要對其組成和結構進行全面的解析。近年來，國內外圍繞人乳寡糖分離分析的研究工作逐漸增加，本文從人乳寡糖前處理、分離分析和結構表征三方面對當前主要研究進展進行了綜述，以期為人乳寡糖結構與功能的深入研究工作提供參考。

1 人乳寡糖的預處理方法

人乳寡糖主要存在于乳清液中，通常的提取方法需要將母乳中的脂肪和蛋白質進行去除。脂肪的去除方法通常采用低溫離心的方式，蛋白質主要采用有機溶劑沉淀，經過上述兩步前處理過程后獲得的乳清液主要含有乳糖和寡糖成分。乳糖和寡糖的結構性質類似，含量是寡糖的5～20倍，是對寡糖分析干擾最大的成分，通常需要一定的前處理方法對高含量的乳糖進行去除。

尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography, SEC)是分離人乳寡糖的傳統(tǒng)技術，其分離過程是根據(jù)被分析物的分子體積大小及形狀，按順序被洗脫出色譜柱而達到分離的目的。人乳寡糖在SEC上的洗脫順序依次為唾液酸化寡糖、聚合度從高到低的中性寡糖、乳糖。Asakuma等[10]采用Bio Gel P-2、DEAE Sephadex A-50和Bio Gel P-4依次對人乳寡糖樣品進行純化和粗分離，最后得到中性寡糖組分，衍生化后繼續(xù)用反相色譜進行定量分析的方法，對日本人群中不同哺乳期8種中性寡糖含量變化進行了研究。由此可見使用 SEC 不僅可以去除乳糖，還可以實現(xiàn)寡糖的初步分離，在早期寡糖化合物純化方面得到了廣泛應用，但由于其處理的通量比較低，不適用于高通量的樣品分析。

固相萃取(solid phase extraction, SPE)技術是應用最為廣泛的樣品前處理技術之一，具有高通量、易自動化、操作靈活等優(yōu)點，石墨化碳是寡糖類樣品預處理的常用固相萃取吸附材料。Lebrilla團隊針對人乳寡糖設計了一個高通量SPE處理流程[11]，該流程同時實現(xiàn)了寡糖還原、脫鹽、脫乳糖以及分離中性糖和酸性糖等目標，配合后面的納升-液相芯片質譜分析(nano-LC chip)可以實現(xiàn)人乳寡糖的定性定量分析。近期本課題組發(fā)展了一種在線SPE親水色譜質譜聯(lián)用的方法(圖2)，通過兩種帶有不同電荷的親水色譜柱對寡糖的選擇性差異，實現(xiàn)了人乳和其他哺乳動物乳汁中唾液酸化寡糖的分離分析，結果顯示人乳同其他哺乳動物乳寡糖種類和含量具有巨大的差異性，該方法具有較高的檢測靈敏度，更重要的是采用在線的前處理方法避免了繁瑣的離線SPE處理過程，同時提高了方法的重復性和穩(wěn)定性[12]。

圖2 在線SPE-HILIC-MS分析的示意圖[12]Fig.2 Schematic illustration of the online SPE-HILIC-MS[12].

除了上述幾種常用的前處理方法，也有用膜分離技術等實現(xiàn)蛋白和乳糖去除，Karina等[13]使用納濾膜技術對牛乳中的3’-SL、6’-SL和N-乙酰半乳糖胺化乳糖進行了富集，采用不同種類、分子量的膜對寡糖富集效果進行了考察，實現(xiàn)了從實驗級放大到工業(yè)級的轉化。Antonio等[14]采用兩步膜技術對山羊乳寡糖進行純化和富集，先采用超濾膜(截留分子量50 kDa)將大部分蛋白去除，然后，透過液采用納濾膜(截留分子量1 kDa)除去鹽、乳糖及小分子量的可溶性蛋白，得到的截留液即為寡糖餾分，最后使用HPAEC-PAD對山羊乳中的寡糖進行Profiling分析。膜分離技術在一定程度上存在乳糖去除不完全以及寡糖損失等缺點，限制了其應用。

2 人乳寡糖的分離分析方法

近年來隨著研究者們對人乳寡糖的關注度增加，分離分析方法的報道也越來越多，如高pH陰離子交換色譜、石墨化碳液相色譜、親水作用色譜、反相色譜、毛細管電泳等，本文就上述幾種常用技術進行分別介紹。

2.1 高pH陰離子交換色譜(high pH anion exchange chromatography, HPAEC)

低聚糖是一種以半縮醛或半縮酮形式存在的多羥基醛或酮。在強堿性條件下, 會部分或全部以陰離子形式存在，從而在陰離子交換柱上被保留并得到分離。然而，傳統(tǒng)的硅膠基質的離子交換色譜柱在強堿條件下非常不穩(wěn)定，因而限制了其使用。近年來，發(fā)展的聚合物基質的離子交換色譜柱，在廣泛的pH范圍內，具有較高的機械和化學穩(wěn)定性，促進了高效分離低聚糖和相關化合物技術的發(fā)展。HPAEC與脈沖安培檢測器(pulsed amperometric detector, PAD)聯(lián)用，其方法具有高分辨率、高選擇性和低檢測限的特點，該方法已被廣泛應用于母乳寡糖的定性和定量分析，尤其是對寡糖異構體的分離[15～19]。寡糖經過凝膠柱將中性和酸性人乳寡糖預分離并去除乳糖后，采用HPAEC-PAD方法進行寡糖單體的分離分析，尤其是寡糖異構體可以得到很好的分離，該方法常用于對高含量的人乳寡糖進行定性定量分析。Thurl 等[15]使用HPAEC方法研究了不同人群和不同哺乳期寡糖含量變化情況，針對14種中性寡糖和6種非巖藻糖化的酸性寡糖進行分析，并利用德國哺乳期婦女3～90 d的母乳樣本考察了哺乳不同時期和母親血型對寡糖含量的影響。雖然HPAEC-PAD對人乳寡糖具有很好地分離選擇性，但由于其前處理過程較為繁瑣，并且其流動相體系不能直接和質譜聯(lián)用，只能借助標準品對寡糖定性，一定程度上限制了 HPAEC的應用。

2.2 石墨化碳液相色譜(porous graphitized carbon chromatography, PGC)

石墨化碳液相色譜是一種常用于分離寡糖和糖結合物的分離方法，石墨化碳材料對寡糖能夠很好地保留以及分離選擇性，尤其是寡糖異構體。同時，PGC對還原性寡糖的α和β差向異構化也能夠很好地區(qū)分，然而，這種分離容易導致圖譜的復雜性，是不需要的分離性能，因此通常在PGC柱分離前，需要將還原性寡糖先進行還原。

Lebrilla和他的合作者廣泛的將PGC用于HMOs的分析。他們發(fā)展了基于PGC前處理方法和HPLC PGC Chip/TOF MS的標準流程用于母乳寡糖的Profiling分析[11]。整個過程如下：母乳通過低溫離心脫脂，有機溶劑沉淀除蛋白，得到脫脂除蛋白的母乳寡糖樣品，使用硼氫化鈉還原后，無孔石墨化碳SPE柱凈化脫鹽，得到母乳寡糖總餾分或母乳寡糖分級的餾分，再進行HPLC PGC Chip/TOF MS分析。同時，基于保留時間、精確分子量和質譜碎片信息，建立了一個包含40個中性寡糖和30個酸性寡糖的人乳寡糖數(shù)據(jù)庫[20,21]。該方法廣泛用于各種人乳寡糖輪廓分析中，如對不同哺乳期[22]、早產母親[23]及分泌類型[24]，以及其他動物乳寡糖分析中，如靈長類[25]、豬[26]、牛[27,28]等。PGC-MS方法不僅應用于寡糖輪廓分析中，很多學者也利用此開展了人乳寡糖絕對定量分析[29,30]。鑒于人乳寡糖標準品難于獲取，寡糖間性質接近，Lebrilla實驗室采用少量標準品擬合虛擬標準曲線借此對其他寡糖定量分析，開展了對20個人群樣本的49個寡糖的分析[31]。

2.3 親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)

親水作用方法是解決極性化合物保留與分離的常用方法[32]，采用極性固定相和水溶性有機溶劑(主要為乙腈) -水為流動相，為強極性化合物如糖類化合物的分離分析提供了一個很好的選擇。作為一種新型的色譜分離手段，HILIC克服了正相色譜和反相色譜在極性化合物分離過程中的不足，同時能夠提供與反相色譜截然不同的分離選擇性。此外，由于其流動相含有高濃度的有機溶劑，有利于增強電噴霧離子源質譜的離子化效率進而提高檢測靈敏度，與質譜具有很好的兼容性。然而，HILIC用于人乳寡糖的分析還相對較少[33], 目前多用于動物乳寡糖分析[34～40]。一般在進行HILIC分析時，會對寡糖進行衍生化處理，來改善峰型、分離選擇性(尤其是異構體)及檢測靈敏度。2-氨基苯甲酰胺(2-AB)是應用較為廣泛的衍生化試劑，Benet等[41]發(fā)展了一種在線去除剩余衍生化試劑的親水色譜方法分析人乳寡糖，并將該方法用于對中國城市(北京、廣州、蘇州)母乳樣本中的10種2-AB標記的HMOs進行了定量分析[42]，在最近的報道中他們用麥芽三糖作為內標物將檢測的人乳寡糖的數(shù)量從10種擴展到20種[43]。

2.4 毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)及其他方法

毛細管電泳具有較高的分離能力和靈敏度，常被作為糖類化合物的分離和鑒定的一種有效分離工具[44～46]，結合熒光或者紫外檢測器應用于衍生化的人乳寡糖分析中，也有研究者將其與質譜結合進行人乳和嬰兒糞便中寡糖的檢測。由于其分析的樣品要求帶有電性，所以較適用于唾液酸化寡糖的分析。Newburg[47,48]發(fā)展了一種CE-UV(205 nm)方法，并將其用于分離、鑒定和定量人乳中12種未標記的唾液酸化寡糖，結果顯示具有較好的異構體分離效果。Monti等[49]利用相似的方法分析了不同動物(牛、羊和馬)乳中唾液酸化寡糖。對于中性寡糖，由于不帶電荷，不能直接進行CE分離，一般需要使用攜帶負電荷的發(fā)色團或熒光團物質進行衍生化，而唾液酸化寡糖進行衍生化后可以改善分析選擇性和檢測靈敏度，例如Galeotti團隊[50]將寡糖使用2-aminoacridone進行衍生化后，采用CE-UV(254 nm)對人乳中17種中性和酸性寡糖進行了表征，一些寡糖異構體，如LST a、LST b和LST c，2’-FL和3-FL，LNFP I、LNFP II和 LNFP III能夠被很好地分離。CE結合MS，不僅能夠獲得很好地分離，也能夠獲得寡糖的結構信息，包括寡糖異構體，可以用于人乳寡糖定量及輪廓分析。

除上述方法外，其他方法例如衍生化后的寡糖也可以經過反相色譜[51～53]進行分離，但是反相色譜對于寡糖異構體分離能力有限，使其應用受到了一定的限制。紙色譜、薄層色譜[54,55]和尺寸排阻色譜[56,57]是較早用于母乳寡糖分離分析的方法，這些方法在分離效率、檢測靈敏度和異構體分離選擇性上都存在一定的局限，現(xiàn)在已經逐漸被色譜柱與檢測器聯(lián)用方法所取代。

3 人乳寡糖結構鑒定技術研究

糖類分子的結構非常復雜，人乳寡糖的結構分析包括單糖組成分析、寡糖序列分析、巖藻糖和唾液酸修飾位點分析。20世紀80年代末期，基質輔助激光解析和電噴霧技術的發(fā)明，使有機質譜獲得了突破性的進展，擴大了質譜的應用范圍，也給糖類化合物的結構分析帶來了較大的進展。核磁共振技術是化合物精確結構解析的最常用手段，但是受限于人乳寡糖單體獲取較為困難，核磁共振技術需要的樣品量較大，在一定程度上限制了其應用，本文就上述兩種鑒定技術在人乳寡糖結構鑒定中應用進展進行了介紹。

3.1 基于質譜技術的結構表征

基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)除具有高靈敏度、快速、準確、高通量、易于實現(xiàn)自動化等特點外，同時還能耐受樣品中不揮發(fā)性鹽，不需要進行脫鹽處理，簡化了樣品的操作過程。在離子化過程中，不易引起源內裂解，而形成準分子離子峰或準分子離子加和峰，可用于對人乳寡糖的單糖組成進行推斷，也可以用于大量樣本中快速的profiling分析。Berndt等[58]采用MALDI-MS對人乳中非衍生化的寡糖餾分進行了分析，在人乳中發(fā)現(xiàn)了聚合度大于20的酸性寡糖和聚合度大于35的中性寡糖，這些高聚合度寡糖的發(fā)現(xiàn)拓展了人們對人乳寡糖組成的認識。Kunz等[59]使用MALDI Q-TOF MS/MS方法，對大量母乳樣本中寡糖種類進行分析，同時結合二級質譜碎片建立碎片結構與血型關系，從而開展高通量快速的樣本輪廓分析。但MALDI-MS僅能給出糖的組成信息，不能夠給出具體的連接位置及連接鍵信息，因此無法用于精確結構判斷。

電噴霧質譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)技術的出現(xiàn)，是生物大分子測定技術的重要突破。ESI顯著優(yōu)點是被分析物可以帶多電荷，從而大大擴展了質譜的質量測定范圍，不僅如此，電噴霧質譜的二級碎片結構還可以給出寡糖的連接順序和連接鍵構型信息，因此常用于母乳寡糖定性定量分析及結構表征。Chai等[60,61]采用ESI-MS/MS負離子模式分別對人乳中中性和酸性寡糖進行質譜斷裂規(guī)律表征，在這種模式下，寡糖不需要進行衍生化，就能夠得到異構體的特征碎片信息，依據(jù)此可以鑒定唾液酸、巖藻糖的取代位置和寡糖的連接方式。Pfenninger等[62,63]對寡糖斷裂規(guī)律進行了詳細的綜述。與中性寡糖相比，酸性寡糖的唾液酸基團在二級碎裂中容易脫落，由此產生的唾液酸碎片離子的信號強度非常高，與之相比，其他特征碎片的信號強度弱，給結構鑒定尤其是異構體的鑒定帶來一定的難度。近期，郎銀芝等[64]通過ESI-MSn方法對人乳寡糖高含量的8種酸性寡糖的解析進行了詳細的介紹，為其他唾液酸寡糖的解析提供了參考。

3.2 核磁共振技術 (nuclear magnetic resonance,NMR)

核磁共振技術是20世紀中期發(fā)展起來的一種新技術，給糖結構解析工作帶來了很多方便，特別是二維核磁共振技術的出現(xiàn)和發(fā)展, 使得 NMR 成為糖類結構解析的重要工具，在解決糖類化合物的糖苷鍵構型、糖的種類、糖殘基數(shù)目、糖與糖的連接位置、糖與糖的連接順序等方面具有重要的作用。NMR不需要標準品即可進行定性分析，這對于母乳寡糖中新的未知的糖定性分析具有顯著地優(yōu)勢，但它對化合物的純度要求較高，重量需在毫克級以上，在用NMR對化合物進行定性前，一般需要對目標化合物進行分離純化。Chai等[65]結合ESI-MS和核磁共振技術對聚合度為10的不同人乳寡糖異構體進行結構解析，他們還采用相同的方法對一個聚合度為12的寡糖新結構進行了解析。

4 展望

盡管近年來人乳寡糖已建立較多的分析方法，從最開始的凝膠色譜和紙色譜相結合的方法，到高效陰離子交換色譜、毛細管電泳色譜，以及以石墨化碳為代表的反相色譜方法，這些研究多數(shù)以表征寡糖含量為目標，因此只是得到了寡糖的含量信息而沒有獲得高純度的單體寡糖樣品。與此同時，受限于人乳寡糖單體樣品的獲取問題，許多生物功能難于深入開展研究。而目前人乳寡糖單體尚缺少系統(tǒng)的制備方法，這與寡糖的分離方法局限和分離效率不高存在一定的關系，因此，人乳寡糖的分離純化技術方面仍有較大的空間需要繼續(xù)研究和探索。

謹以此文致敬中國科學院大連化學物理研究所七十華誕(1949-2019)!