中藥腦還丹對APP/PS1小鼠海馬區(qū)細胞內(nèi)[Ca2+]i的影響

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阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是發(fā)生在老年期或老年前期的一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以進行性持續(xù)性學習記憶功能減退為主要臨床特征，以老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元丟失為主要病理改變?，F(xiàn)代研究證實，鈣離子穩(wěn)態(tài)失調及自由基生成過多是體內(nèi)一切細胞死亡的“共同通道”[1]。腦還丹是在具有抗衰老作用古方草還丹基礎上，結合現(xiàn)代中藥藥理研究，以骨碎補、熟地黃、石菖蒲等中藥組成的復方；既往研究表明，腦還丹能使AD病人的臨床癥狀得到明顯改善；可明顯提高去勢老齡大鼠血清胰島素樣生長因子水平[2]，穩(wěn)定去勢老齡大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結構，維持其突觸密度[3]，抑制快速老化鼠SAMP8腦內(nèi)過氧化反應及神經(jīng)元超微結構的損傷，促進抗凋亡基因bcl-x及海馬CA1區(qū)PSD-95、Shank-1蛋白的表達[4-5]。本研究以反映神經(jīng)細胞凋亡情況的細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)為主要觀察指標，以APP/PS1雙轉基因小鼠為AD模型，觀察腦還丹對其學習記憶能力及細胞內(nèi)[Ca2+]i的影響，進一步探討腦還丹改善學習記憶功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3個月齡SPF級雄性APP/PS1雙轉基因小鼠48只，同月齡、同遺傳背景、C57BL/6J小鼠12只，體重30 g±5 g，以上動物均購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所[生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2013-0002]。

1.2 實驗用藥 腦還丹由人參、熟地黃、骨碎補等組成，采用顆粒劑(廣東一方制藥有限公司提供，批號312046T)，鹽酸多奈哌齊片[商品名：安理申，規(guī)格：每片5 mg，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司提供，批號130437B]，實驗時均按照需要，用蒸餾水配制成所含生藥量不同濃度的藥液。

1.3 主要試劑及儀器 YLS-Q6小鼠灌胃器[安合盟(天津)科技發(fā)展有限公司]，Morris水迷宮(由中山大學解剖教研室提供)，F(xiàn)luo-4/AM熒光探針[東仁化學科技(上海)有限公司]，超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠)，BD FACS Calibur流式細胞儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)。其他如雙蒸水、胰酶、水合氯醛、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將上述48只小鼠隨機分為4組，分別為模型組、腦還丹低劑量組、腦還丹高劑量組及多奈哌齊組，每組12只；另選取C57BL/6J小鼠12只作為正常對照組。

1.4.2 藥物配制及給藥 腦還丹及多奈哌齊用藥劑量按動物體表面積比率等劑量法換算[6]，以成人(體重60 kg為參考)常規(guī)劑量折算為小鼠的基礎劑量，常規(guī)劑量2倍作為高劑量。用雙蒸水將腦還丹顆粒沖劑配制成濃度為1 g/mL和0.5 g/mL藥液，鹽酸多奈哌齊配制成濃度為0.24 mg/mL藥液，冷藏保存，使用時加至常溫并攪拌均勻。按以下劑量對給藥組小鼠進行灌胃：腦還丹高劑量組41.6 g/(kg·d)，腦還丹低劑量組20.8 g/(kg·d)，多奈哌齊組8.0 mg/(kg·d)。正常對照組、模型組小鼠每日灌以等量蒸餾水。每日1次，持續(xù)4個月。

1.4.3 Morris水迷宮實驗 采用由中國科學院研制Morris水迷宮(中山大學北校區(qū)解剖教研室)進行行為學測試[7]，包括隱蔽平臺實驗5 d及空間探索實驗1 d。以此評價小鼠的學習記憶能力及多奈哌齊和腦還丹對其影響。

1.4.4 標本采集 Morris水迷宮測試結束后，每組取8只小鼠斷頭處死，無菌條件下剝出全腦，沿大腦縱裂切開，并用玻璃棒分離出海馬組織，放入凍存管立即置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆?，用于細胞?nèi)[Ca2+]i的檢測。海馬區(qū)細胞內(nèi)[Ca2+]i檢測：①將海馬組織置于生理鹽水中進行機械剪切，之后添加胰酶進行消化，制備單細胞懸液，加入終濃度為4 μmol/L的Fluo-4/AM熒光探針，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min后除去Fluo-4/AM工作液；用PBS溶液洗滌細胞3次，之后加入PBS重懸細胞，37 ℃培養(yǎng)箱孵育約30 min后加入PBS液，調整細胞懸液濃度為1×105/mL，以流式細胞儀檢測細胞內(nèi)[Ca2+]i。②結果統(tǒng)計：以發(fā)射波長為516 nm，激發(fā)波長為488 nm條件下使用流式細胞儀檢測到的神經(jīng)細胞內(nèi)[Ca2+]i的熒光強度作為統(tǒng)計值，進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠定位航行實驗結果比較 定位航行實驗的觀察主要包括小鼠找到平臺的時間(潛伏期)和搜索路線。隨著觀察時間延長，模型組小鼠潛伏期明顯長于正常對照組(P<0.01)；從第3天開始，腦還丹高劑量組低劑量組及多奈哌齊組潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)，與腦還丹低劑量組比較，腦還丹高劑量組和多奈哌齊組找到平臺所用時間明顯縮短(P<0.05)；多奈哌齊組與腦還丹高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1、圖2、表1。

圖1 正常對照組與模型組小鼠逃避潛伏期比較

圖2 腦還丹低劑量組、高劑量組、多奈哌齊組及模型組小鼠逃避潛伏期比較

表1 各組小鼠隱蔽平臺實驗結果比較(±s) s

搜索平臺路線方面，隨著時間增加，各組小鼠采取邊緣式、隨機式探索次數(shù)逐漸減少，而趨向式、直線式探索路線次數(shù)逐漸增加。從第2天開始，正常對照組趨向式、直線式探索路線次數(shù)較其他4組明顯增加。第4天、第5天腦還丹低劑量組、高劑量組及多奈哌齊組采取直線式、趨向式路線次數(shù)明顯多于模型組。詳見圖3。

A：正常對照組；B：模型組；C：腦還丹低劑量組；D：腦還丹高劑量組；E：多奈哌齊組

2.2 各組小鼠空間探索實驗結果比較 平臺撤去后，第6天進行空間探索實驗。記錄小鼠在平臺象限內(nèi)停留時間，以測試小鼠對平臺的空間記憶能力。正常對照組、腦還丹低劑量組、高劑量組和多奈哌齊組平臺象限停留時間較模型組顯著延長(P<0.01)；且腦還丹高劑量組、多奈哌齊組較低劑量組平臺象限內(nèi)停留時間明顯延長(P<0.05)；正常對照組、腦還丹低劑量組、高劑量組和多奈哌齊組首次跨越平臺時間較模型組縮短(P<0.05或P<0.01)，且腦還丹高劑量組、多奈哌齊組較腦還丹低劑量組縮短(P<0.05)。與腦還丹低劑量組比較，腦還丹高劑量組小鼠在定位航行中所用時間較少，平臺象限內(nèi)停留時間較長(P<0.05)。詳見表2。

2.3 各組小鼠海馬區(qū)細胞內(nèi)[Ca2+]i比較 流式細胞儀檢測結果顯示(見圖4)，5組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞內(nèi)[Ca2+]i比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=122.86，P<0.05)；與模型組比較，各組海馬區(qū)神經(jīng)細胞內(nèi)[Ca2+]i濃度明顯減少(P<0.01)；與腦還丹低劑量組比較，腦還丹高劑量組[Ca2+]i明顯減少(P<0.01)；多奈哌齊組與腦還丹高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖5、表3。

表2 各組小鼠空間探索實驗結果比較(±s) s

圖4 各組小鼠海馬細胞[Ca2+]i比較

與模型組比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 各組小鼠海馬細胞[Ca2+]i比較(±s) nmol/L

3 討 論

有研究表明，在AD發(fā)生發(fā)展過程中伴有鈣離子穩(wěn)態(tài)失調。正常情況下鈣離子在細胞內(nèi)外分布受細胞膜和質膜的屏障作用及細胞膜鈣通道調節(jié)。Ca2+通道是鑲嵌膜上有孔道的蛋白質，其對鈣離子的通透性受電壓、受體及胞內(nèi)鈣量等調控。生理條件下，由于質膜上和胞膜上Ca2+-ATP酶(鈣泵)的存在，細胞內(nèi)鈣離子保持低濃度狀態(tài)，僅為細胞外的1/20 000。作為細胞內(nèi)第二信使，鈣離子參與神經(jīng)細胞的發(fā)育分化、遞質的釋放、突觸的傳遞、激素的放大效應、酶的激活等多種生理過程。質膜受損或鈣泵供能障礙，可發(fā)生鈣離子內(nèi)流，引起鈣離子穩(wěn)態(tài)失調而導致鈣超載的發(fā)生；細胞內(nèi)過多的游離Ca2+可激活Ca2+調節(jié)的核酸內(nèi)切酶、CaM等多種酶，進而引起一系列基因、蛋白的表達異常，從而導致細胞功能障礙甚至死亡[8]。在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中Aβ及活性氧自由基通過引起神經(jīng)元鈣超載而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的。Ca2+穩(wěn)態(tài)失調導致的鈣超載在AD發(fā)病過程中的作用已經(jīng)得到人們的重視。已有學者研究發(fā)現(xiàn)，通過減少細胞內(nèi)的[Ca2+]i可有效改善癡呆動物模型的學習記憶功能[9]。

APP/PS1雙轉基因小鼠是以APP單轉基因小鼠與PS1單轉基因小鼠進行雜交，或運用DNA重組技術將APP和PS1兩種外源突變基因同時傳染、整合到小鼠的基因組中而得到。實驗研究表明，APP/PS1雙轉基因小鼠在4.5月齡時，大腦皮層即出現(xiàn)淀粉樣沉積和SP，且隨著月齡增加，大腦皮層SP數(shù)量面積明顯增大[10]；至9月～12月齡時，可出現(xiàn)與AD病人相似的SP[11]。行為學方面研究發(fā)現(xiàn)，3個月齡時APP/PS1雙轉基因小鼠已出現(xiàn)明顯的學習記憶功能障礙。這一結果表明APP/PS1雙轉基因小鼠表現(xiàn)與AD病人相似的發(fā)病進程，是研究AD較理想的動物模型。

本研究結果顯示，與模型組比較多奈哌齊組和腦還丹干預組小鼠在隱蔽平臺試驗中所用時間明顯縮短，而空間探索試驗中在原平臺象限停留時間明顯增加，提示腦還丹、多奈哌齊均可明顯改善APP/PS1雙轉基因小鼠的學習、記憶功能。海馬區(qū)[Ca2+]i檢測提示，模型組較正常對照組海馬細胞[Ca2+]i明顯增高(P<0.01)；腦還丹干預組及多奈哌齊組[Ca2+]i較模型組明顯降低(P<0.01)。

鈣離子穩(wěn)態(tài)失調與學習記憶功能的關系推斷可能有以下幾方面原因：①機體老化時伴隨全身臟器、組織和細胞的老化；②機體老化只是外在表象，其實質是細胞生物膜的受損；③細胞膜損傷導致各離子通道的功能異常，其中Ca2+通道所受影響尤為明顯，導致Ca2+內(nèi)流增加，使Ca2+在胞內(nèi)聚積，激活細胞內(nèi)質網(wǎng)、線粒體鈣庫釋放，使細胞內(nèi)Ca2+濃度進一步升高，加劇細胞老化；④細胞老化，導致線粒體功能障礙，細胞供能障礙，鈣泵失常，進一步導致細胞內(nèi)Ca2+潴留；⑤細胞老化與Ca2+穩(wěn)態(tài)失調，形成惡性循環(huán)，進而導致突觸丟失、細胞凋亡等一系列病理變化，導致APP/PS1雙轉基因小鼠的學習記憶功能障礙。這可能是APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力明顯低于C57BL/6J小鼠的原因之一，而腦還丹和多奈哌齊可通過穩(wěn)定細胞內(nèi)[Ca2+]i，減輕下游的細胞功能損害，保護神經(jīng)細胞功能，進而改善APP/PS1雙轉基因小鼠的學習記憶功能。

綜上所述，腦還丹可顯著改善APP/PS1雙轉基因小鼠的學習記憶功能，其機制可能與其穩(wěn)定細胞內(nèi)[Ca2+]i，降低Ca2+超載，減少自由基產(chǎn)生，保護細胞生物膜有關。腦還丹高劑量組療效優(yōu)于低劑量組的原因可能為藥物有效成分含量較高，增加血藥濃度，改善學習記憶功能。