丹參多酚酸鹽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠Ang-2的影響

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缺血性腦血管病是常見腦血管病之一，腦缺血區(qū)由中心缺血區(qū)和周圍缺血半暗帶組成。缺血半暗帶是腦卒中治療的靶點(diǎn)，若采取有效治療，可使缺血半暗帶瀕臨死亡腦組織獲救[1]。血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)是血管生成素家族一員，由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，參與引發(fā)內(nèi)膜去穩(wěn)定、打破血管穩(wěn)定信號(hào)、導(dǎo)致血管消退、啟動(dòng)血管形成信號(hào)、促進(jìn)血管形成等[2]。注射用丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的丹參多酚酸鹽類化合物，主要成分是丹參乙酸鎂，具有改善微循環(huán)、抗栓、抗氧化、抗炎和抑制缺血再灌注損傷等作用[3]。以往研究證實(shí)，丹參多酚酸鹽能改善大鼠局部腦缺血后腦梗死面積，并可延長(zhǎng)低壓缺氧小鼠存活時(shí)間[4-5]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察注射用丹參多酚酸鹽在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用，通過(guò)檢測(cè)腦缺血半暗帶Ang-2變化，探討丹參多酚酸鹽的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只健康雄性SD大鼠(體重330 g左右)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠晝夜循環(huán)光照，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 丹參多酚酸鹽(上海綠谷生物公司)；HE染色液(上?；瘜W(xué)試劑公司)；兔抗大鼠Ang-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；山羊抗兔二抗和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購(gòu)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 大鼠MCAO模型制備及分組 采用改良Longa法[6]，大鼠左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈尼龍線線栓法。頸部正中切口3 cm～4 cm，分離皮下組織，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，用眼科剪在左側(cè)頸總動(dòng)脈上剪一斜口，插入栓線，直至遇到阻力且栓線進(jìn)入18 mm～20 mm，縫合皮下組織及皮膚，建立MCAO模型。局灶性腦缺血采用MCAO 48 h；局灶性腦缺血再灌注采用MCAO 2 h后再灌注48 h(MCAO/R)。Sham組手術(shù)步驟同MCAO組，僅不行血管內(nèi)插入栓線。將大鼠隨機(jī)分為6組：Ⅰ組(Sham+生理鹽水)、Ⅱ組(Sham+丹參多酚酸鹽)、Ⅲ組(MCAO+生理鹽水)、Ⅳ組(MCAO +丹參多酚酸鹽)、Ⅴ組(MCAO/R+生理鹽水)和Ⅵ組(MCAO/R+丹參多酚酸鹽)。將注射用丹參多酚酸鹽溶于生理鹽水中，濃度3 mg/mL。每只大鼠腹腔注射2.0 mL～2.4 mL生理鹽水或丹參多酚酸鹽，注射2日，每日2次。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在大鼠MCAO或MCAO/R后48 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈征象；3分：向病灶對(duì)側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走及意識(shí)喪失。

1.5 HE染色 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，將大鼠斷頭取腦，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，片厚6 μm，將切片置于HE染色液中染色，中性樹脂封片。

1.6 免疫組化 將大鼠腦組織在4%多聚甲醛中固定，隨后分別在20%、30%蔗糖中存放至沉底。將腦組織包埋，冰凍切片機(jī)切20 μm腦片，腦片用丙酮浸泡20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次。再用甲醛30 mL+PBS 10 mL+30% H2O2500 μL浸泡10 min，PBS洗3次。應(yīng)用二步法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)：加兔抗大鼠Ang-2抗體(1∶1 000)室溫孵育6 h，PBS洗3次，加山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次，DAB顯色，裱片，梯度脫水，透明，中性樹膠封片。每張切片在高倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察每個(gè)視野Ang-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯示：Ⅰ組和Ⅱ組大鼠神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)基本正常；Ⅲ組和Ⅳ組大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分顯著增高(P<0.05)；Ⅳ組評(píng)分低于Ⅲ組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Ⅲ組和Ⅳ組比較，Ⅴ組和Ⅵ組大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05)，且Ⅵ組低于Ⅴ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

2.2 各組大鼠神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)比較 HE染色顯示：Ⅰ組和Ⅱ組大鼠細(xì)胞層次清晰，結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，細(xì)胞胞漿、核染色均勻，間質(zhì)內(nèi)未見出血和壞死；Ⅲ組和Ⅳ組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)有片狀壞死，細(xì)胞排列松散，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞深染固縮，胞漿尼氏體消失，胞核固縮，但兩組基本無(wú)差異。Ⅴ組和Ⅵ組大鼠缺血區(qū)有少量灶狀壞死，神經(jīng)細(xì)胞固縮程度輕，胞膜及核仁清晰可見，Ⅵ組較Ⅴ組壞死情況減輕。詳見圖2。

2.3 各組大鼠腦缺血半暗帶Ang-2表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果(400×)顯示：各組大鼠相關(guān)腦區(qū)均存在Ang-2陽(yáng)性表達(dá)，Ⅰ組和Ⅱ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Ⅰ組和Ⅱ組比較，Ⅲ組和Ⅳ組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)均增加(P>0.05)，且Ⅳ組多于Ⅲ組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Ⅰ組和Ⅱ組比較，Ⅴ組和Ⅵ組Ang-2陽(yáng)性表達(dá)均增加(P>0.05)，且Ⅵ組較Ⅴ組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖3、圖4。

3 討 論

缺血性腦血管病極大地危害人們健康，腦缺血時(shí)存在多種腦損傷疾病的病理生理，因而如何減輕腦缺血后神經(jīng)損傷，一直是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。臨床研究證實(shí)，注射用丹參多酚酸鹽可改善腦卒中病人神經(jīng)功能缺損，增加腦血管流量[7]，但其作用機(jī)制不明確。本研究通過(guò)評(píng)估丹參多酚酸鹽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織病理形態(tài)變化的影響，觀察丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠急性期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，并檢測(cè)大鼠腦缺血半暗帶Ang-2表達(dá)，探討丹參多酚酸鹽可能的作用機(jī)制。

圖2 各組大鼠大腦HE染色

圖3 各組大鼠大腦免疫組化染色

圖4 丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠腦缺血半暗帶Ang-2表達(dá)影響

本研究結(jié)果顯示：大鼠MCAO或MCAO/R后大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分及腦組織病理形態(tài)變化均顯著增高，而腹腔注射丹參多酚酸鹽可改善大鼠MCAO或MCAO/R后大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分及腦組織病理形態(tài)變化，且大鼠腦缺血半暗帶Ang-2表達(dá)高于其他組。正常生理情況下，由于大鼠血腦屏障存在，大多數(shù)藥物較難通過(guò)血腦屏障，但腦缺血性損傷時(shí)，其通透性增高，難以通過(guò)血腦屏障藥物可進(jìn)入腦組織[8]。有研究指出，局灶性腦缺血后，Ang-2表達(dá)上調(diào)，與其受體結(jié)合，促進(jìn)微血管生成同時(shí)，對(duì)血腦屏障產(chǎn)生破壞作用[9]。近年相關(guān)研究表明，腦組織損傷后可出現(xiàn)再塑性，神經(jīng)元發(fā)生機(jī)制與血管再通有密切關(guān)聯(lián)，因此血管生成為腦損傷修復(fù)提供新靶點(diǎn)[10]。血管生成素及其受體酪氨酸激酶受體在腦缺血后微血管生成發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Ang-2影響血管生成與局部微環(huán)境有關(guān)聯(lián)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)存在時(shí)，Ang-2破壞已有血管的穩(wěn)定，加快重塑血管基底膜，從而激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管出芽和平滑肌細(xì)胞聚集黏附，形成新的血管[12]。目前已經(jīng)證實(shí)，缺血性腦損傷能上調(diào)神經(jīng)元Ang-2表達(dá)[13]，這與本研究結(jié)果觀察到腦缺血再灌注大鼠中Ang-2表達(dá)是一致的。以往動(dòng)物研究已表明，腦缺血時(shí)梗死周邊有新生血管生成，2 d～7 d梗死灶周邊有毛細(xì)血管重建，之后逐漸發(fā)展成小血管，并可通過(guò)發(fā)芽和套疊方式延伸到缺血中心區(qū)，在此過(guò)程，Ang-2及其受體發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。本研究中，MCAO介導(dǎo)的腦缺血再灌注大鼠血腦屏障遭到破壞，丹參多酚酸鹽通過(guò)血腦屏障，到達(dá)大鼠缺血半暗帶，通過(guò)上調(diào)該區(qū)域Ang-2表達(dá)，從而對(duì)瀕死神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。