劉成 姜天翼 王靜 陳文兵 王珊珊 鐘傳青

（山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，濟(jì)南 250101）

水體富營養(yǎng)化是指水中的氮、磷含量超標(biāo)，引起藻類等水生植物瘋長，導(dǎo)致水中溶解氧水平下降、水生生物出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象［1］。相比氮元素，磷元素在水體富營養(yǎng)化中發(fā)揮的作用更加明顯，一般認(rèn)為當(dāng)水體中總磷含量超過0.015 mg/L時就會造成水體富營養(yǎng)化［2-3］。為解決水體富營養(yǎng)化問題，通常是對污水先處理再排放，目前對污水處理普遍采用活性污泥法?；钚晕勰喾ǔ淄ǔ０瑑煞N方式：一種是傳統(tǒng)活性污泥法，只對污水中的碳源有好的去除效果；另一種是強(qiáng)化生物除磷（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR）［4］。EBPR 具體是指除磷污泥中特定微生物在厭氧、好氧交替條件下，成為優(yōu)勢菌種，并超量吸磷儲存在體內(nèi)，最終以沉淀的形式排出，達(dá)到除磷效果，上述具有超強(qiáng)除磷能力的微生物稱為聚磷菌（Phosphate accumulating organisms，PAOs）。隨著對聚磷微生物的不斷探索，發(fā)現(xiàn)一種新型PAOs—積磷小月菌（Microlunatus phosphovorus），其代謝方式與典型PAOs有所不同。本文將通過比較典型PAOs和積磷小月菌在強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中的作用和機(jī)理，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 PAOs在強(qiáng)化生物除磷中的作用及機(jī)理

傳統(tǒng)活性污泥法只能吸收微生物正常生長所需的磷，隨污泥沉淀而去除，如在常規(guī)的生物二級處理中，污泥含磷量為污泥干重的1.5%-2.3%，以污泥排除方式只能獲得10%-30%的去除效果，而EBPR的除磷效果是常規(guī)生物除磷的3-7倍［5］，EBPR中污泥含磷量基本在4%-6%左右，有些能達(dá)8%-12%，最高可達(dá)15%，系統(tǒng)除磷效率達(dá)80%-95%，EBPR具有除磷效率高、剩余污泥少、剩余污泥肥效高、經(jīng)濟(jì)可靠的優(yōu)點［6］。EBPR系統(tǒng)得以實現(xiàn)，PAOs在其中扮演重要角色，且在活性污泥眾多微生物中占有一定比例。在厭氧條件下，PAOs能通過Poly-P水解獲取吸收有機(jī)底物的能量，在與其他好氧細(xì)菌競爭中獲得優(yōu)勢［7］。例如，β變形菌門-2亞綱中的紅環(huán)菌屬，簡稱“Accumulibacter”，是一種典型的 PAOs［8］。

典型PAOs的代謝機(jī)理是在厭氧條件下分解Poly-P產(chǎn)生ATP，同時吸收水體中存在的揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）如乙酸等，隨后乙酸被乙酰化成乙酰輔酶A，在這過程中消耗ATP，乙酰輔酶A聚合后和還原性物質(zhì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）發(fā)生還原反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，最后經(jīng)聚合反應(yīng)生成聚羥基烷酸（Polyhydroxyalkanoates，PHA）［6］。PHA作為還原產(chǎn)物，反應(yīng)過程中所需還原性物質(zhì)來自糖降解途徑（EMP），EMP不僅提供ATP，而且為電子傳遞鏈提供NADH2，EMP途徑作為還原力的來源被廣泛接受［6，9］，在好氧條件下，分解厭氧條件下儲存的PHA產(chǎn)生糖原和ATP，NADH2失電子產(chǎn)生NADH+、H+，將PO4-運輸?shù)襟w內(nèi)合成 Poly-P［10］（圖 1）。

圖1 典型PAOs除磷過程中代謝方式

隨著對PAOs的不斷探索，其含義逐漸拓展，后延伸至一切超越自身生長所需、能夠過量吸磷的微生物，厭氧階段合成PHA不再是必要條件［10］。積磷小月菌（Microlunatus phosphovorus）代謝方式與典型PAOs在不同培養(yǎng)條件下有所差異，其在強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)中的作用和機(jī)理如下文所述。

2 積磷小月菌及其在強(qiáng)化生物除磷中的作用

在我國現(xiàn)有的刑法體系下，刑法分則第五章“侵犯財產(chǎn)犯罪”的各個罪名中，立法者在描述犯罪對象時均使用了“財物”一詞。按照體系解釋的原則，至少在第五章的每個罪名中，“財物”應(yīng)做統(tǒng)一內(nèi)涵式的理解。不能認(rèn)為詐騙罪的對象包括財產(chǎn)性利益，而盜竊罪的對象不包括財產(chǎn)性利益，這樣的解釋方法是違反罪刑法定原則的。由此可知，盜竊罪的犯罪對象同樣也包括財產(chǎn)性利益。

圖2 M. phosphovorus形態(tài)對比顯微鏡照片（放大倍數(shù)×1000）［14］

圖3 M. phosphovorus電鏡穿透照片（A）對數(shù)生長期（B）穩(wěn)定期［14］

3 積磷小月菌在強(qiáng)化生物除磷中的作用機(jī)理

“40年滄桑巨變，這是中國人民在人類發(fā)展史上所創(chuàng)造的偉大奇跡，造就這個奇跡的密碼，就是堅持中國共產(chǎn)黨的領(lǐng)導(dǎo)。”舒展說。

3.1 積磷小月菌中PHA的研究進(jìn)展

Poly-P是由高能磷酸鍵連接正磷酸鹽殘基形成的線性聚合物，主要作為能量儲存器（低分子量Poly-P）和磷儲存器（高分子量Poly-P），它的合成與降解是PAOs能夠除磷的原因之一［2，23］。在大腸桿菌中，多聚磷酸鹽激酶（PPK）最終由一個可逆反應(yīng)將ATP中的磷轉(zhuǎn)變?yōu)镻oly-P中的磷：

3.2 積磷小月菌中的糖代謝

PHA是很多細(xì)菌都可以合成的胞內(nèi)聚酯，在生物體內(nèi)主要作為細(xì)胞碳源和能量的儲存物質(zhì)［2］。關(guān)于積磷小月菌中PHA是否為碳源和能量儲存物質(zhì)的研究，Santos等［18］使用核磁共振方法，用13C標(biāo)記的葡萄糖為碳源在厭氧、好氧交替的SBR中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在13C的轉(zhuǎn)移過程中沒有形成PHA（含13C）。后Akar 等［19］采用純培養(yǎng)方法，用氣相色譜的方法進(jìn)行物質(zhì)定量，發(fā)現(xiàn)在各種碳源和不同厭氧、好氧條件下，積磷小月菌胞內(nèi)都能積累PHA，PHA合成酶很可能與Poly-P合成酶同為誘導(dǎo)型酶。Kawakoshi等［20］認(rèn)為積磷小月菌在好氧條件下產(chǎn)生PHA，且存在一種新的PHA合成系統(tǒng)，典型PAOs中存在ActP和phaABC基因，兩者分別負(fù)責(zé)糖原吸收和PHA逐步合成，Kawakoshi等發(fā)現(xiàn)積磷小月菌中存在替代phaABC系統(tǒng)的基因：MLP_23080、MLP_23090、MLP_12780， 且 與 典 型 PAOs合 成PHA的方式有明顯區(qū)別。Akar 等通過定量確定PHA數(shù)量后，根據(jù)好氧、厭氧條件下PHA數(shù)量對代謝過程中所用碳源進(jìn)行推斷。Santos和Kawakoshi等的觀點不謀而合，分別從核磁共振和基因方面做出解釋，積磷小月菌中的PHA很可能只作為細(xì)胞中的物質(zhì)存在，而不作為磷去除過程中的碳源和能量發(fā)揮作用，進(jìn)一步研究確定積磷小月菌中碳源和能源顯得尤為重要。

大腸桿菌中存在磷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，當(dāng)外界磷過量時，由低親和力的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（PitA）吸磷，依靠質(zhì)子動力獲能，并且PitA的合成不受PHO調(diào)控子控制，當(dāng)外界濃度低時，高親和性的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Pst）被PHO調(diào)節(jié)子誘導(dǎo)［22］。積磷小月菌中同樣存在兩種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Pit和Pst），Pit轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以質(zhì)子為推動力，而Pst轉(zhuǎn)運系統(tǒng)需要消耗ATP，積磷小月菌有效的磷吸收與釋放能力，可能與Pit基因的數(shù)量在已知的放線菌中數(shù)量最多有關(guān)，在無需消耗ATP的情況下，Pit調(diào)節(jié)的可逆磷轉(zhuǎn)運過程能夠有效應(yīng)對Ploy-P合成與降解所引起的細(xì)胞內(nèi)磷水平急劇變化［20］。

圖4 M. phosphovorus除磷過程中糖代謝

3.3 積磷小月菌中的磷代謝

活性污泥中存在的非聚磷菌能發(fā)酵葡萄糖等物質(zhì)產(chǎn)生VFA供給典型PAOs進(jìn)行后續(xù)代謝反應(yīng)，而積磷小月菌可直接利用葡萄糖，這是其碳源和能量供應(yīng)的特殊之處。Tanaka等［17］研究發(fā)現(xiàn)積磷小月菌中存在磷酸依賴的葡萄糖激酶（Polyphosphatedependent glucokinase，Poly-P-GK）， 與 ATP-葡 萄糖激酶（ATP-glucokinase，ATP-GK）相比，Poly-P-GK是嚴(yán)格以Poly-P為能量的葡萄糖激酶，在厭氧條件下，以葡萄糖和Poly-P為底物，在Poly-P-GK的作用下合成中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate，G-6-P）。之后代謝反應(yīng)中，G-6-P中的磷被釋放，葡萄糖被發(fā)酵成醋酸，這和厭氧條件下磷快速釋放相符合［17，20］。Santos等［18］研究發(fā)現(xiàn)積磷小月菌厭氧條件下將葡萄糖發(fā)酵成醋酸，磷的釋放會刺激葡萄糖吸收；在好氧條件下，積磷小月菌可以從厭氧階段產(chǎn)生的醋酸中獲取能量用于生長和合成Poly-P。積磷小月菌通過EMP途徑發(fā)酵葡萄糖為醋酸，Poly-P-GK催化合成G-6-P是EMP途徑的第一步，研究發(fā)現(xiàn)積磷小月菌中存在兩種ppgk基因（MLP_05430和 MLP_26610）［20-21］，這是第一次在一種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)含兩種ppgk基因，利用Poly-P，在兩種ppgk基因作用下進(jìn)行糖酵解，如圖4所示。

積磷小月菌超強(qiáng)生物除磷能力與其特殊生物除磷機(jī)理有關(guān)，積磷小月菌在除磷過程中所需碳源、能量來源和磷轉(zhuǎn)運能力，以及Poly-P的合成與代謝能力與典型PAOs有所差異。積磷小月菌體內(nèi)存在PHA，但它可利用葡萄糖和Poly-P作為碳源和能量，其超強(qiáng)除磷能力與菌體有效的磷轉(zhuǎn)運能力和Poly-P合成代謝能力有關(guān)。

磷酸鹽也能在外切聚磷酸酶（PPX）作用下從多聚磷酸鹽中釋放出來，在PPX作用下，能夠使Poly-P分解，這一過程伴隨著由ADP向ATP的合成，而ppk和ppx基因位于同一操縱子上［24］。積磷小月菌中好氧合成Poly-P與厭氧分解Poly-P同樣需要PPK和PPX的參與。有研究認(rèn)為積磷小月菌中存在4個假定的ppk基因，其中包括一個ppk1（MLP_47700） 和 3個ppk2同 系 物（MLP_05750、MLP_50300、MLP_23310），作為放線菌的一種，積磷小月菌所含ppk基因的數(shù)量相對較多。已有研究表明多個數(shù)量的ppk基因與Poly-P的高轉(zhuǎn)換率和積累能力有關(guān)［12，20］。另外積磷小月菌中同樣存在水解Poly-P末端磷酸鹽的ppx基因，但只含有一個ppx2同系物（MLP_44770）［20］，積磷小月菌有較少的PPX也有可能與其超強(qiáng)的聚磷能力有關(guān)，其磷代謝過程如圖5所示。

本課題組從污泥中分離出一株積磷小月菌JN459［25］，對JN459菌株好氧厭氧條件下的轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，JN459在好氧厭氧條件下與Poly-P代謝 相 關(guān) 的 基 因ppk（MLP_47700，MLP_50300和ML-P_05750）、ppgk（MLP_05430 和 MLP_26610）、ppx（MLP_44770）、pap（MLP_23310）和ppnk（MLP_17420）表達(dá)水平存在顯著差異，厭氧條件下磷酸葡萄糖激酶（MLP_05430）與ATP依賴的磷酸NAD激酶（MLP_17420）的高表達(dá)揭示這兩種酶在利用Poly-P作為生長所需能源中發(fā)揮著重要作用［26］。

圖5 M. phosphovorus磷的代謝方式

4 展望

EBPR活性污泥中積磷小月菌占有一定比例，與典型PAOs相比，積磷小月菌具有更強(qiáng)除磷能力，在Poly-P代謝過程中糖原的利用方式不同，且具有更有效的磷轉(zhuǎn)運能力和合成能力，加強(qiáng)積磷小月菌生化代謝反應(yīng)和遺傳學(xué)特性研究對污水除磷具有重要意義。未來對積磷小月菌的研究可以從以下幾個方面入手：①已有文獻(xiàn)中對積磷小月菌厭氧條件下碳源和能量供應(yīng)有明顯闡述，但對好氧條件下物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量供應(yīng)沒有詳盡說明，可以深入研究；②通過積磷小月菌的純培養(yǎng)，運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，繼續(xù)探索和鑒定mRNA與蛋白質(zhì)，研究其代謝機(jī)理，從而更好地反應(yīng)出不同蛋白質(zhì)在厭氧、好氧條件下表達(dá)水平的差異，以確定某些基因在積磷小月菌除磷過程中的作用；③對代謝反應(yīng)和遺傳學(xué)特性深入研究，找到在磷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和Poly-P合成代謝過程中的關(guān)鍵基因，構(gòu)建除磷能力更強(qiáng)的工程菌，以期達(dá)到更好的除磷效果；④對積磷小月菌產(chǎn)PHA及其副產(chǎn)物的能力進(jìn)行研究，對將其作為生產(chǎn)PHA的工業(yè)菌種可行性進(jìn)行探索。