響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草蛋白超聲波輔助提取工藝及其營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

侯若琳 劉鑫 項(xiàng)凱凱 陳磊 鄭明鋒 傅俊生

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蛹蟲草（Cordyceps militarisL. Link），又名北冬蟲夏草、北蟲草等，屬于子囊菌門、核菌綱、麥角菌科、蟲草屬［1］，它是一種珍貴的食藥用真菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。研究表明蛹蟲草含有許多活性成分，如蟲草素、多糖、蟲草酸、麥角甾醇、甘露醇和蛋白質(zhì)［3-7］等。目前蛹蟲草相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)主要集中在利用蟲草素、腺苷、多糖等活性成分，而對(duì)于其蛋白質(zhì)的提取性研究報(bào)道及市場(chǎng)上針對(duì)蛹蟲草蛋白進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品卻并不多見(jiàn)。蛋白質(zhì)作為蛹蟲草的主要成分之一，約占蟲草干重的30%，研究證實(shí)它具有許多生物學(xué)活性，Qing等［8］研究表明蛹蟲草蛋白可以抑制小鼠4T1腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草蛋白中的纖溶酶可以預(yù)防血栓的形成。隨著蛹蟲草蛋白研究不斷的深入，諸多的生物活性將逐漸被揭示，用途也將日益廣泛，加強(qiáng)蛹蟲草蛋白提取方法研究對(duì)于蛹蟲草蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

常規(guī)的蛋白質(zhì)堿法提取工藝提取時(shí)間長(zhǎng)、提取溫度高、提取效率低、容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性等缺點(diǎn)，而超聲波輔助提取法具有提取時(shí)間短、提取效率高、環(huán)境污染小和成本低等優(yōu)點(diǎn)，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白活性喪失［10-13］。為避免超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而破壞蛹蟲草蛋白的活性，本實(shí)驗(yàn)首先將蛹蟲草子實(shí)體粉末超聲一段時(shí)間，使蛹蟲草細(xì)胞壁破碎后，停止超聲，繼續(xù)攪拌提取，使蛋白進(jìn)一步溶出，提高蛋白提取效率，并進(jìn)一步對(duì)所提取蛋白的氨基酸組成與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了分析，為蛹蟲草蛋白營(yíng)養(yǎng)保健食品的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛹蟲草子實(shí)體 購(gòu)于福建省古田縣；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 KH3200B型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；85-1型恒溫磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；ST 20型pH計(jì)：美國(guó)奧豪斯公司；K 9840型凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器有限公司；ST16R型離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；Agilent1100液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 總蛋白含量測(cè)定 參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定-食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中第一法進(jìn)行測(cè)定分析［14］，經(jīng)過(guò)測(cè)定蟲草子實(shí)體的蛋白含量為28.88 g/100 g。

1.2.2 提取蛋白含量測(cè)定 采用BCA法測(cè)定，取20μL一定濃度梯度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入到微孔板中，再加入180 μL的BCA工作液，充分混勻后置于37℃孵育30 min，冷卻到室溫，在562 nm處檢測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)上述同樣方法測(cè)定蛋白提取液吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中蛋白濃度。

1.2.3 蛹蟲草蛋白的提取 精確稱取干燥蛹蟲草子實(shí)體粉末1.00 g溶于不同pH和料液比的緩沖溶液中→25℃超聲提取→關(guān)閉超聲后繼續(xù)攪拌提?。ㄒ陨暇唧w方法細(xì)節(jié)見(jiàn)1.2.4）→6 000 r/min 離心10 min→用BCA法檢測(cè)上清液蛋白的含量→上清液調(diào)節(jié)至蟲草蛋白的等電點(diǎn)（pH=4）→7 000 r/min離心10min→棄上清，沉淀用去離子水復(fù)溶→調(diào)節(jié)pH至中性→冷凍干燥得到蛹蟲草蛋白粉。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察超聲時(shí)間、pH、料液比、攪拌提取溫度和攪拌提取時(shí)間對(duì)蟲草蛋白提取率的影響，以蛋白提取率為指標(biāo)（表1）。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 響應(yīng)面因素的確定 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Desig-expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波輔助提取蛹蟲草蛋白工藝。

1.2.6 提取蛋白氨基酸組成與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià) 參照于海燕等［15］的方法進(jìn)行測(cè)定。樣品前處理：稱取0.2 g樣品于密封瓶中，加入10 mL 6 mol/L HCl（含1%苯酚），充氮?dú)? min，封瓶，110℃水解22 h。取出冷卻，定容至10 mL，90℃下氮吹揮干，0.01mol/L HCl溶解定容，過(guò)0.45 μm濾膜測(cè)定。檢測(cè)條件：采用安捷倫公司自動(dòng)在線柱前衍生化方法，一級(jí)氨基酸與鄰苯二甲醛（OPA）、二級(jí)氨基酸與芴甲氧羰酰氯（FMOC）衍生后過(guò)柱檢測(cè)。色譜條件：AAA-C18色譜柱（4.6×150 mm，3.5 μL）；檢測(cè)信號(hào)：紫外338 nm，熒光（EX=266 nm，EM=305 nm）；流動(dòng)相A：40 mmol/L磷酸二氫鈉（pH7.8）；流動(dòng)相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10，采用梯度洗脫方式（表2）。采用氨基酸評(píng)分（AAS）來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表2 HPLC洗脫條件

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0和Desig-expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。采用t檢驗(yàn)分析兩組之間的差異。P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲草蛋白提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、料液比1∶40、攪拌提取溫度25℃、攪拌提取時(shí)間2 h的條件下，超聲時(shí)間分別為10 min、20min、30 min、40 min，研究超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響。超聲時(shí)間越長(zhǎng)，有利于細(xì)胞壁的破碎和蛋白的溶出，但超過(guò)30 min時(shí)，蛋白提取率基本不變，因此選取超聲30 min為超聲輔助提取蛹蟲草蛋白的最佳超聲時(shí)間（圖1-A）。

2.1.2 攪拌提取溫度對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、料液比1∶40、超聲30 min、攪拌提取時(shí)間2 h的條件下，攪拌提取溫度分別為25℃、35℃、45℃、55℃，研究提取攪拌溫度對(duì)蛋白提取率的影響。蛹蟲草蛋白提取率隨著攪拌提取溫度的升高呈增加趨勢(shì)，當(dāng)溫度提升至35℃后，提取率變化不大；提取溫度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的活性下降，同時(shí)加大能源的消耗，因此選取35℃為超聲輔助提取蛹蟲草蛋白的最佳攪拌提取溫度（圖1-B）。

2.1.3 攪拌提取時(shí)間對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、料液比1∶40、超聲時(shí)間30 min、提取溫度35℃的條件下，攪拌提取時(shí)間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，研究攪拌提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響。當(dāng)攪拌提取時(shí)間超過(guò)1 h時(shí)，提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低（圖1-C），這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可溶性蛋白含量下降，同時(shí)也會(huì)加大能源的消耗，所以本實(shí)驗(yàn)在攪拌提取時(shí)間為1 h的條件下進(jìn)行蛋白提取較為適宜。

2.1.4 pH對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響 在料液比1∶40、超聲時(shí)間30 min、提取溫度35℃、攪拌提取時(shí)間1 h的條件下，pH分別為6.5、7.5、8.5、9.5，研究pH對(duì)蛋白提取率的影響。提取率隨著pH的增加先升高后降低，并且pH過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和水解，活性降低（圖1-D），所以本實(shí)驗(yàn)在pH為8.5的條件下進(jìn)行蛋白提取較為適宜。

2.1.5 料液比對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響 在pH8.5、超聲時(shí)間30 min、攪拌提取溫度35℃、攪拌提取時(shí)間1 h的條件下，料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，研究料液比對(duì)蛋白提取率的影響。蛹蟲草蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的升高成增加趨勢(shì)，但超過(guò)1∶40時(shí)，增加緩慢（圖1-E）；考慮到料液比過(guò)大會(huì)造成溶劑浪費(fèi)并且不利于后處理，所以本實(shí)驗(yàn)在料液比為1∶40的條件下進(jìn)行蛋白提取較為適宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超聲時(shí)間為30 min，攪拌提取溫度為35℃對(duì)蛹蟲草蛋白的提取最佳，從提取率出發(fā)，選定超聲時(shí)間為30 min，攪拌提取溫度為35℃的前提下，采用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以A（pH）、B（料液比）和C（攪拌提取時(shí)間）為自變量，以蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表3）。

圖1 各單因素對(duì)蛹蟲草蛋白質(zhì)提取率的影響

表3 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

通過(guò)Desig-expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表4所列結(jié)果進(jìn)行分析，得到A（pH）、B（料液比）、C（攪拌提取時(shí)間）3個(gè)因素與Y之間的回歸方程：Y=82.87 +3.09 A + 2.28 B +0.84C-15.59A2+ 1.04B2-2.00C2-1.00 AB-0.18AC-0.69 BC；對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，該模型的p＜0.0001，說(shuō)明該模型具有高度的顯著性；失擬項(xiàng)P=0.272 2，失擬不顯著，說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，表明模型實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合較好，可解釋蛋白提取率響應(yīng)值的變化，可利用該回歸方程較好的分析和與預(yù)測(cè)最佳提取條件。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化及模型驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果的分析，可以預(yù)測(cè)最優(yōu)提取條件及提取率，由回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知（表5），模型的一次項(xiàng)A、B影響極顯著（P≤0.01），C影響顯著（P≤0.05），二次項(xiàng)A2、C2影響極顯著（P≤0.01），B2影響顯著（P≤0.05），交互項(xiàng)AB影響顯著（P≤0.05）；根據(jù)一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值可知，各因素對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響主次順序?yàn)閜H＞料液比＞攪拌提取時(shí)間。根據(jù)回歸分析結(jié)果繪制響應(yīng)曲面，以確定pH、料液比、攪拌提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響（圖2）。對(duì)回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，可求得極值點(diǎn)，即A=0.067，B=1.0，C=0.034，用Desigexpert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)，最優(yōu)反應(yīng)條件為：pH8.57、料液比1∶50、攪拌提取時(shí)間72 min，在最優(yōu)提取條件下，蛋白提取率可達(dá)86.26%。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)（pH8.57、料液比1∶50、反應(yīng)時(shí)間72 min）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，3次實(shí)驗(yàn)提取率的平均值為85.6%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在± 0.77%內(nèi)，由此可知，模型預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間有較好的擬合性，能夠較好的反映不同條件下蛋白提取率的變化。

表5 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

2.4 超聲波輔助取組與不超聲組對(duì)比

為了驗(yàn)證超聲波對(duì)蛹蟲草蛋白提取的促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了一組不超聲的對(duì)照。結(jié)果（表6）表明超聲波輔助提取比不超聲的對(duì)照組的蛋白質(zhì)提取率提高了34.75%，這是因?yàn)槌暡梢援a(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)和攪拌作用來(lái)破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白更易溶出。

表6 超聲波輔助提取與不超聲對(duì)照組提取率對(duì)比

圖2 響應(yīng)面法立體分析圖

2.5 提取蛋白氨基酸組成及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

超聲波輔助提取法所提取的蛹蟲草蛋白含有17種氨基酸（色氨酸未測(cè)），含有7種人體必需氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA /TAA為44.4%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA /NEAA為79.84，均大FAO/WHO的推薦值40%和60%；除賴氨酸、蛋氨酸+胱氨酸低于世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和糧農(nóng)組織（The Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）標(biāo)準(zhǔn)模式，其余必需氨基酸均與WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式相當(dāng)（表7），表明蛹蟲草蛋白質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表7 提取蛹蟲草蛋白氨基酸成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

3 討論

響應(yīng)面法是一組用于探索和優(yōu)化過(guò)程參數(shù)的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法。它使用一個(gè)簡(jiǎn)單的方程來(lái)定義測(cè)試變量如何影響結(jié)果，并探索變量之間的相互關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)將超聲波輔助提取技術(shù)和響應(yīng)面法相結(jié)合來(lái)優(yōu)化蛹蟲草蛋白提取工藝參數(shù)，得到了最佳提取工藝參數(shù)，并且采用超聲波輔助提取方法比不超聲的對(duì)照組的蛋白質(zhì)提取率提高了34.75%，表明該方法是一種有效的蛹蟲草蛋白提取方式。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)最優(yōu)條件下所提蛹蟲草蛋白氨基酸組成與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了分析。研究結(jié)果顯示所提取的蛹蟲草蛋白含有豐富的氨基酸，其中谷氨酸含量最高（10.35%），其次是天門冬氨酸（9.20%）。谷氨酸在人體內(nèi)可促進(jìn)氮基丁酸的合成，從而降低血氨，促進(jìn)腦細(xì)胞呼吸，可以用于治療神經(jīng)精神疾病，如精神分裂癥和腦血管障礙等引起的記憶和語(yǔ)言障礙、小兒智力不全等。天門冬氨酸是一種良好的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，可用于治療心臟病、肝臟病、高血壓癥，具有防止和恢復(fù)疲勞的作用［17］。蛹蟲草蛋白必需氨基酸占總氨基酸的比值EAA/TAA為44.4%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值EAA /NEAA為79.84%，均大FAO/WHO的推薦值40%和60%，表明所提蛹蟲草蛋白質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，該研究為蛹蟲草蛋白營(yíng)養(yǎng)保健食品的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

蛹蟲草蛋白超聲波輔助提取的最優(yōu)條件為：料液比1∶50、pH=8.57，150 W功率下超聲30 min，然后關(guān)閉超聲波，置于35℃條件下繼續(xù)攪拌提取72 min，此條件下蛋白質(zhì)提取率達(dá)到85.6%，是不超聲對(duì)照組蛋白提取率的1.68倍，與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為±0.77%。所提取的蛹蟲草蛋白含必需氨基酸占總氨基酸的比值為44.4%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為79.84%，均大于世界糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織的推薦值。