孔維歡 王晶晶 萬鵬程 石國(guó)慶

（1. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬丁型冠狀病毒（PDCOV）均屬于冠狀病毒科，是兩種能夠引起仔豬腹瀉、脫水嚴(yán)重致死等癥狀的冠狀病毒。其中PEDV對(duì)不同品種和各年齡段的豬都可以發(fā)生感染，尤其是出生在10日齡以內(nèi)的哺乳仔豬最易感染死亡［1-2］。由PEDV感染的腹瀉疾病我們稱為豬流行性腹瀉（PED），是以仔豬消化道病變癥狀為主要特征的急性、高度接觸性傳染病，也是目前嚴(yán)重危害中國(guó)規(guī)模化養(yǎng)豬行業(yè)仔豬腹瀉病的主要病原之一［3］。早在1976年我國(guó)就首次報(bào)道了PEDV的存在，之后在2010年開始我國(guó)大面積暴發(fā)PEDV，引起仔豬因腹瀉、脫水致死率高達(dá)100%，這給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［4］。

PDCOV是近年來新發(fā)現(xiàn)的單股正鏈RNA病毒，一種能夠引起仔豬急性水樣腹瀉的新發(fā)δ冠狀病毒［5］，也是危害世界生豬養(yǎng)殖業(yè)潛在的因素。在2012年研究者Woo等［6］曾在豬糞便樣品中檢測(cè)到了PDCOV，接著美國(guó)俄亥俄州從腹瀉仔豬中也首次發(fā)現(xiàn)了PDCOV［7］，隨后加拿大和韓國(guó)等也相繼報(bào)道了PDCOV，且陽性檢出率達(dá)25%［8］。在2004-2014年Dong等［9］對(duì)我國(guó)安微、廣西、湖北、江蘇4個(gè)地區(qū)病料檢測(cè)中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了PDCOV，說明PDCOV早在十幾年前就已經(jīng)在我國(guó)豬群中存在。

近年來，畜牧業(yè)規(guī)?；B(yǎng)殖迅猛發(fā)展，由于環(huán)境和畜禽個(gè)體等因素的相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌病毒發(fā)生變異而難以控制，造成經(jīng)濟(jì)上的巨大損失。例如，引起仔豬腹瀉疾病的PEDV變異毒株目前在全國(guó)范圍內(nèi)普遍傳播，疫苗免疫也很難有效的防控。而且當(dāng)前許多疾病的臨床癥狀極為相似，病毒的混合感染并發(fā)癥非常嚴(yán)重、難以診斷。如引起仔豬腹瀉病的PEDV和PDCOV多混合感染，且臨床癥狀、流行病學(xué)和病理變化非常相似［10-11］，僅通過臨床觀察、常規(guī)診斷方法，很難滿足臨床上快速鑒別診斷的需求，因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。基于以上研究背景，本研究以分離的毒株為研究對(duì)象，主要采用單一RT-PCR和二重RT-PCR的方法及特異性、敏感性試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化建立一種能夠快速靈敏地鑒定出一種病毒或雙重病毒混合感染的檢測(cè)技術(shù)，并將其用于臨床樣品的初步檢測(cè)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬丁型冠狀病毒（PDCOV）細(xì)胞分離毒株以及采集的疑似病毒性腹瀉糞便樣品，PRV、CSFV、PPV等病毒均由新疆農(nóng)墾科學(xué)院獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供保存。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出物（Biowest公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），溴化乙錠（EB）、無水乙醇、氯仿、異丙醇（北京化工廠），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ddH2O（北京全式金公司），dNTP、Taq 酶、10×Buffer、DNA Marker（TaKaRa公司），質(zhì)粒提取試劑盒、PMD18-T載體、EcoRⅠ、Hind Ⅲ內(nèi)切酶（寶生物工程有限公司）。

1.1.3 主要器材 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（XMT-152A）、恒溫水浴鍋（DKS22）、離心機(jī)（德國(guó)SIGMR公司）、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene公司）、核酸電泳儀（Bio-Rad公司）、分光光度計(jì)（Thermo公司）、PCR儀（Eppendorf公司）、1.5 mL離心管和培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA單鏈的合成 取 200 μL病毒樣品，按照 Trizol（Invitrogen）試劑說明書分別提取各病毒的總RNA。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值和RNA濃度，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。確保所提總RNA的OD值在1.8-2.0之間，無蛋白和基因組污染。按照 TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank已收錄發(fā)表的PEDV和PDCOV基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物跨內(nèi)含子并處在基因的高保守區(qū)域。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 單一RT-PCR擴(kuò)增 以陽性對(duì)照疫苗株RNA轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分別以表1中兩對(duì)引物進(jìn)行單對(duì)引物擴(kuò)增。采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL， 上 下 游 引 物 F/R 各0.5 μL，Taq 酶 0.4 μL，ddH2O 19.1 μL，cDNA 模板1 μL。94℃預(yù)變性4 min后，進(jìn)入94℃變性30 s，PEDV 55℃、PDCOV 56℃退火 30 s，72℃ 45 s的循環(huán)，共循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min，12℃保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。將電泳分析正確的目的片段，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，進(jìn)行PCR克隆與測(cè)序，DNA測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成，所獲序列經(jīng)鑒定正確。

表1 二重RT-PCR引物設(shè)計(jì)結(jié)果

1.2.4 二重RT-PCR的建立 在單對(duì)引物擴(kuò)增成功的基礎(chǔ)上，將目的基因PEDV-M、PDCOV-N加入同一PCR反應(yīng)體系中配制二重RT-PCR反應(yīng)混合液。將兩對(duì)引物同時(shí)加入擴(kuò)增體系，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)優(yōu)化最佳 PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，兩對(duì)上下游引物F/R各0.5 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 17.1 μL，cDNA 模板各 1 μL。建立二重RT-PCR擴(kuò)增優(yōu)化體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min后，進(jìn)入94℃變性30 s，PEDV、PDCOV均56℃退火30 s，72℃ 45 s的循環(huán)，共35次循環(huán)；最后72℃延伸10 min，12℃保存。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，將鑒定正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α載體，篩選陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.5 特異性實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1，1.2.3優(yōu)化的二重RT-PCR體系條件分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的PRV、CSFV、PPV的核酸進(jìn)行提取反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，并以PEDVPDCOV混合模板擴(kuò)增為陽性對(duì)照。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將PEDV和PDCOV細(xì)胞毒株混合物為陽性對(duì)照。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度，將cDNA按10倍以內(nèi)的濃度梯度稀釋，調(diào)整核酸濃度，分別以它們?yōu)槟０?，按照已?yōu)化的二重RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，檢測(cè)其敏感性。

1.2.7 臨床應(yīng)用 取實(shí)驗(yàn)室保存的疑似病毒性腹瀉糞便樣品12份，按照上述方法建立的二重RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)是否被PEDV和PDCOV感染。

2 結(jié)果

2.1 單對(duì)引物特異性RT-PCR擴(kuò)增

對(duì)PEDV病料RNA進(jìn)行提取反轉(zhuǎn)錄，通過RTPCR方法對(duì)PEDV-M基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，獲得一條大小為750 bp的特異性目的條帶（圖1），并進(jìn)行了測(cè)序鑒定。

圖1 PEDV凝膠電泳圖

然后對(duì)PDCOV病料RNA進(jìn)行提取反轉(zhuǎn)錄，通過RT-PCR方法對(duì)目的基因片段PDCOV-N進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，獲得一條長(zhǎng)度為372 bp的特異性目的條帶（圖2）。經(jīng)測(cè)序鑒定是所設(shè)計(jì)的目的片段。從圖中第1泳道可以看出，在56℃退火溫度下也能擴(kuò)增出750 bp大小的PEDV-M目的基因。由此，初步確定二重PCR的擴(kuò)增溫度為56℃。

圖2 PDCOV凝膠電泳圖

2.2 PEDV-PDCOV二重RT-PCR檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化

在上述研究基礎(chǔ)上，以PEDV-M和PDCOV-N凝膠回收產(chǎn)物為模板，按照1.2.4設(shè)計(jì)的多重PCR優(yōu)化條件進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果（圖3）顯示，在第2泳道同時(shí)擴(kuò)增出PEDV和PDCOV的雙重條帶，且目的條帶大小分別與預(yù)期目的基因片段大小一致，說明優(yōu)化的最佳退火溫度為56℃。

圖3 二重RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照所建立的二重RT-PCR體系對(duì)PRV、CSFV、PPV和PEDV-PDCOV混合模板分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖4）顯示，PRV、CSFV、PPV等病毒基因均為陰性，而PEDV-PDCOV混合模板擴(kuò)增出了相應(yīng)病毒的目的片段，即說明了該二重RT-PCR體系的特異性強(qiáng)。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)5 μL的PEDV和PDCOV的PCR回收產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)Marker的5 μL的亮度比較，初步檢測(cè)確定回收產(chǎn)物的基因濃度為200 ng/μL和250 ng/μL，然后將核酸濃度分別稀釋。兩核酸混合使其濃度稀釋為200 ng，100 ng，50 ng，25 ng，10 ng，5 ng，1 ng，0.5 ng，0.1 ng的總量，以此作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖5）表明，核酸量為200 ng，100 ng，50 ng，25 ng，10 ng，5 ng，1 ng，0.5 ng均能擴(kuò)增出相應(yīng)大小片段，但亮度依次減弱的特異性條帶。而0.1 ng濃度核酸并沒有明顯的條帶出現(xiàn)。因此該P(yáng)CR體系能夠擴(kuò)增的核酸濃度下限為100 pg/μL。

圖5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 二重RT-PCR檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用

以建立的二重RT-PCR方法對(duì)采集的12份疑似臨床病例樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示，12份疑似病例樣品中有1份混合病毒感染，1份PEDV感染，2份PDCOV感染，其余8份呈陰性無病毒感染。

圖6 二重RT-PCR臨床檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來，隨著國(guó)內(nèi)集約化規(guī)?；B(yǎng)豬行業(yè)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，豬病毒性疾病的發(fā)生和流行日益嚴(yán)重，發(fā)病率、死亡率也越來越高，且多種病毒的變異或混合感染已成當(dāng)前疫病流行病學(xué)的主要形式和特點(diǎn)［12］。它們的臨床癥狀有許多極為相似之處，這給獸醫(yī)學(xué)者和專家們臨床診斷確定疾病感染帶來了很大的困難，也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)由病毒感染引起仔豬腹瀉脫水等臨床癥狀極為相似的PEDV和PDCOV進(jìn)行單項(xiàng)RTPCR的基礎(chǔ)條件上，參考王隆柏等［13］建立的5種豬病多重PCR檢測(cè)方法，通過對(duì)病毒引物、dNTP、模板用量及反應(yīng)溫度等條件的優(yōu)化，建立了靈敏度好特異性強(qiáng)的PEDV-PDCOV二重RT-PCR快速鑒別診斷的方法。多重PCR在同一體系實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目的基因的特異性擴(kuò)增并不是單項(xiàng)PCR簡(jiǎn)單的混合，例如我們實(shí)驗(yàn)所建立的二重RT-PCR反應(yīng)體系，引物設(shè)計(jì)就是其中一個(gè)最關(guān)鍵的因素。它除了決定著反應(yīng)程序中的退火溫度及引物二聚體的形成與否外，還影響著反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率等。

相對(duì)于耗時(shí)費(fèi)力、敏感性和特異性不高的病毒分離、免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)的豬群疫病檢測(cè)方法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）更能被廣泛應(yīng)用于各種病毒檢測(cè)［14］，但常規(guī)的應(yīng)用多重PCR檢測(cè)多種病毒也費(fèi)時(shí)費(fèi)力。所以，本研究通過單項(xiàng)RT-PCR技術(shù)條件的優(yōu)化擴(kuò)增出了PEDV和PDCOV相應(yīng)的目的片段750 bp、372 bp。初步表明該二重RT-PCR體系的最佳退火溫度為56℃，并通過建立二重RT-PCR優(yōu)化體系得以驗(yàn)證。采用該體系對(duì)PRV、CFSV、PPV進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，以及PEDVPDCOV進(jìn)行濃度梯度敏感性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該二重RTPCR體系特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)。通過臨床疑似病例的檢測(cè)也說明了方法的高效性。

4 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)研究成功建立了PEDV和PDCOV的二重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法靈敏度高、特異性好，高效快捷的特點(diǎn)，在臨床上能夠快速鑒別診斷出PEDV和PDCOV單獨(dú)或混合感染的病例。