喬玉玲 黃錚 秦海艷 宋蘭蘭 陳繼軍 安晨 葉星 毛曉燕

（1. 蘭州生物制品研究所有限責任公司第四研究室 甘肅省疫苗工程技術研究中心，蘭州 730046；2. 上海泰因生物技術有限公司，上海 201499）

人類CD52屬于短鏈GH錨定糖蛋白家族，定位于人1號染色體（1p36.1）［1］，它廣泛分布于人淋巴細胞、單核細胞等造血細胞上，其直接的生物學功能至今尚未明確，但是多組實驗室及臨床數(shù)據(jù)顯示對其進行人工干預及調控，可以治療和預防多種與淋巴細胞有關的疾病［2-4］。目前，全球上市藥品中，針對CD52抗原的主要是賽諾菲（Sano fi）旗下健贊（Genzyme）的單抗藥物Lemtrada（Alemtuzumab）。2013年9月，歐盟委員會（EC）批準其用于活動性復發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥（RRMS）成人患者的治療。2014年11月FDA亦以相同的適應癥批準其在美國上市［5-7］。

由蘭州生物制品研究所有限責任公司研制的抗人-CD52單克隆抗體是一種特異性中和人CD52的重組人源化IgG1治療性單克隆抗體。與小分子及化學藥物相比，單克隆抗體類藥物因為其生產的特殊性、自身結構的復雜性以及眾多的翻譯后糖基化修飾，需要對每批制品的抗體氨基酸序列進行鑒定。而抗體的互補決定區(qū)（Complementarity determining region，CDR）是每一個單克隆抗體所特有的氨基酸序列，也是抗體藥物與抗原產生特異性親和力的來源，所以，采用適當?shù)姆椒▽贵w的CDR區(qū)肽段進行鑒別是對抗體生產的一種有效質控方法。美國藥典藥物處方集、《中國藥典》2015版三部中“人用重組DNA蛋白制品總論”及“人用重組單克隆抗體產品總論”中均要求在制品的理化特性分析中應盡可能地測定目標產品的氨基酸序列，并與基因推斷的理論氨基酸序列進行比較［8-10］。HPLC-肽圖法原理是基于蛋白質經鹽酸胍變性、DTT打斷二硫鍵、烷基化封閉、使用蛋白酶消化成小分子肽段的混合物，再經HPLC反向C18色譜柱分離后，應用質譜分析各個肽段的氨基酸序列。理論上每個不同蛋白消化后有不同的肽段，這些肽段的質量（分子量）就是這個蛋白的肽指紋圖譜。

本論文探討了在抗人-CD52單克隆抗體生產質控的過程中，使用胰蛋白酶在合適的條件下水解單抗，經HPLC反向C18色譜柱分離后，在液質聯(lián)用鑒別CDR區(qū)特征峰的基礎上，建立HPLC-肽圖法。用該方法對抗人CD52單抗進行了肽圖分析，并對該方法按照《中國藥典》四部（2015年版）通則9101—藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行了專屬性、精密度、耐用性驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

重組抗人CD52單克隆抗體（蘭州生物制品研究所有限責任公司第四研究室提供），三氟乙酸、乙腈、冰乙酸購自TEDIA公司；甲醇、二硫蘇糖醇、尿素購自Sigma公司；鹽酸胍購自Solarbio公司；十二水和磷酸氫二鈉、二水和磷酸二氫鈉購自國藥試劑；碘乙酸鈉購自BBI Lifescience公司；胰蛋白酶Trypsin購自Promega公司；10K超濾離心管、0.45 μm濾膜購自Millipore公司；Eclipse XDB-C18 4.6×250 mm 5 μm（Aglient）、進樣瓶購自Agilent公司；液相色譜儀1260購自Agilent公司；Triple-TOF 5600+質譜儀購自AB Sciex公司。

1.2 方法

1.2.1 酶切樣品制備 取300 μg重組抗人CD52單克隆抗體于6 mol/L鹽酸胍變性緩沖液中，加入1 μmol/L DTT，56℃反應 30 min。 加 入 20 μmol/L IAM，37℃避光水浴反應1 h。使用10K超濾濃縮管脫鹽置換至1.5 mol/L尿素緩沖液后，加入Trypsin 3μg，37℃水浴酶切18 h。酶切反應結束后加入20 μL 50%乙酸溶液終止反應。

1.2.2 反相-HPLC檢測酶解產物 采用液相系統(tǒng)HPLC1260進行分離。A液為0.1%TFA水溶液，B液為0.1%TFA乙腈溶液。色譜柱以A液平衡，A、B液梯度變化分離酶解產物。供試品酶解產物由自動進樣器上樣，上樣體積100 μL。紫外檢測波長214nm，柱溫30℃。

1.2.3 質譜條件 供試品酶解產物經高效液相色譜脫鹽及分離后進入Triple-TOF 5600+質譜儀（AB Sciex）進行質譜檢測分析。分析時長：135 min；檢測方式：正離子；TOF MS+掃描范圍：350-1 500 Da；Product Ion+掃描范圍：100-1 500 Da；質譜分辨率：40 000；Exceeds：150 Cps。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得質譜原始數(shù)據(jù) 通過BioPharmaView V1.5（AB Sciex）進行軟件分析，選擇供試品理論序列為數(shù)據(jù)庫，然后進行數(shù)據(jù)庫匹配檢索，分析參數(shù)如下：Enzyme，Trypsin；Fixed modification：Carbamidomethyl（C）；Modification：Oxidation（M），Deamidated（NQ），Protein terminal lys-loss，Gln-＞pyoGlu；M/Z tolerance：±20 ppm。

1.2.5 驗證 用樣品處理專屬性驗證樣品。輔料制劑溶液、樣品溶液、貝伐珠單抗溶液按照1.2.1至1.2.2方法進行制備，0.1%TFA水溶液作為空白對照，各進樣 100.0 μL。

精密度驗證-儀器重復性樣品。按照1.2.1至1.2.2方法對同一批號樣品進行制備，連續(xù)重復進樣6針，進樣體積為100.0 μL。比較6次進樣中目的峰片段的峰面積和保留時間，及其標準偏差（SD）和相對標準偏差%（RSD%）。

精密度驗證-樣品重復性樣品。1.2.1至1.2.2方法對同一批號樣品平行制備6份樣品，每份進樣量為100.0 μL。比較6份平行樣品進樣中目的峰片段的峰面積和保留時間，及其SD和RSD%。

精密度驗證-中間精密度樣品。由同一人員在不同實驗日期對同一批號樣品按照1.2.1至1.2.2方法進行處理，由不同實驗員在同天對同一批號樣品按照1.2.1至1.2.2方法處理。每針進樣量為100.0 μL，集合3次試驗數(shù)據(jù)，分別計算目的峰片段的保留時間和峰面積平均百分比，分別計算其SD和RSD%。

耐用性驗證。考察柱溫變化2、不同胰蛋白酶量（使用同一批次，酶量分別為1.5 μg、3 μg、6 μg）、不同酶切條件（35℃、37℃、39℃）、不同酶切時間（16 h、18 h、20 h），酶切之后不同保存溫度不同保存時間（4℃1 d、2 d、3 d；-25℃1 d、2 d、3 d）。樣品制備同1.2.1至1.1.2。分別計算原條件與各考察因素下的目的峰片段峰面積和保留時間的相對標準偏差。

2 結果

2.1 抗CD52單抗的CDR鑒別

抗CD52單抗為人源化IgG1單抗，由trypsin酶解單抗肽段得到的二級質譜數(shù)據(jù)經過MASCOT數(shù)據(jù)搜索引擎獲得的氨基酸序列。其中輕鏈的覆蓋率為96%，重鏈的覆蓋率為 95%。將三批原液批號為DS201603001、DS201605002、DS201605003與 參 比品（批號RBP201508001）的肽圖結果重疊后如圖1所示。CDR特征肽段如表1所示。

參照2015版中國藥典要求，結合質譜鑒定，確定在現(xiàn)有的前處理條件下該方法有較好的專屬性，可以對重組人源化抗CD52單克隆抗體進行鑒定，并能夠鑒定出CDR區(qū)的特征肽段。

從質譜結果推斷出部分特征肽段的保留時間，結合上述圖譜可以看出，連續(xù)生產的3批原液在Trypsin酶解后在液相圖譜上表現(xiàn)一致，且與參比品一致。3批原液CDR區(qū)的保留時間偏差均≤0.2min。因為重鏈CDR1與輕鏈CDR1在HPLC色譜圖上豐度較低，故選擇重鏈CDR3及其他3個高豐度標志性峰作為監(jiān)測點，其保留時間分別為：49.2±0.2，54.1±0.2，66.5±0.2。

2.2 HPLC-肽圖檢測方法驗證結果

圖1 CD52單抗提取離子流色譜

表1 CD52單抗CDR對應肽段及離子化信息

2.2.1 專屬性結果 輔料制劑圖譜（紅色）與樣品RBP201508001（紫色）用以評估輔料制劑是否對樣品測定造成干擾，流動相A（深藍色）與貝伐珠單抗（綠色）、納武單抗（淺藍色）進一步驗證此方法的專屬性。圖2顯示樣品溶液在出峰位置均無干擾峰。

2.2.2 精密度驗證結果 精密度-儀器重復性結果：連續(xù)6次進樣的肽圖數(shù)據(jù)（表2）顯示，目的峰峰面積的RSD%為2.4%-5.5%。且保留時間的RSD%為0.1%-0.2%，小于5%的可接受標準。該結果表明儀器的重復性良好，偏差屬于接受范圍內。

圖2 專屬性色譜圖

精密度-樣品重復性結果：6份平行樣品的肽圖結果（表3）顯示，目標峰的峰面積RSD%在1.7%-3.8%之間。目標峰的保留時間RSD%在0.1%-0.2%，小于5%的可接受標準。

精密度-中間精密度結果：兩分析人員3次實驗所得數(shù)據(jù)（表4）顯示，目的峰峰面積的RSD%在4.8%-7.6%之間。目的峰保留時間的RSD%在0%-0.2%之間，小于5%的可接受標準。由此中間精密度在可接受范圍內。

2.2.3 耐用性驗證結果 不同酶量（1.5 μg、3 μg、6μg）、不同酶切溫度（35℃，37℃和39℃）和不同酶切時間（16 h，18 h，20 h）、酶切后4℃及-25℃分別保存24 h、48 h、72 h后考察目標峰保留時間RSD%均小于5%的可接受標準。所有考察條件下發(fā)現(xiàn)3 μg胰蛋白酶、37℃和18 h的酶切條件是最合適樣品處理條件。72 h內，酶切后樣品4℃及-25℃保存條件下，目標峰保留時間RSD%無明顯差異。綜上，各考察條件下目的峰的出峰時間與原條件相比，在±1 min范圍內且對各目的峰保留時間影響較小，因此該方法耐用性良好。結果見表5至表9。

表2 儀器重復性結果

3 討論

本研究旨在建立基于質譜檢測結果的HPLC-肽圖法，用于抗CD52單抗的鑒別實驗?？贵w經胰蛋白酶酶解后，使用HPLC反相C18色譜柱對樣品進行分離后質譜檢測，在方法建立過程中，我們分別使用 Eclipse XDB-C184.6×150 mm 5 μm、4.6×250 mm 5 μm（Aglient）色譜柱對樣品進行分析，經比較發(fā)現(xiàn)，4.6×250 mm 5 μm色譜柱對本單抗制品分離效果更好，能有效的對CDR特征峰進行分離，效費比更高。

表3 樣品重復性結果

表4 中間精密度結果

表5 不同胰蛋白酶量的測定結果

表6 不同酶切反應溫度的測定結果

在前期的試驗中，我們還對不同的內切酶進行了驗證，分別選取了胰蛋白酶、糖苷酶、糜蛋白酶對抗CD52單抗進行酶切分析，結果顯示胰蛋白酶對特征CDR區(qū)的酶切效果最好，得到了3個CDR區(qū)的特征峰，分別表征重鏈的CDR1、CDR3及輕鏈的CDR1。但是，仍不能對抗體全部的6個CDR區(qū)進行全覆蓋。傳統(tǒng)檢測方法中使用液質聯(lián)用的技術對抗體氨基酸序列進行分析，但是既耗時耗力且不利于抗體生產過程中的常規(guī)檢測。所以我們選擇在HPLC色譜中豐度較高的重鏈CDR3特征峰及其他3個高豐度且特異性良好的特征峰作為判斷標準［11-13］，建立了HPLC-肽圖法。經驗證該方法專屬性好，輔料成分、異種抗體及樣品處理中所用的試劑對檢測結果均無干擾，且其色譜峰積分面積小于樣品總峰面積的1%；精密度良好，保留時間的RSD%均小于5%；耐用性良好，各考察條件下目的峰保留時間RSD%均在5%的可接受范圍內。

表7 不同酶切反應時間的測定結果

表8 酶切后4℃保存條件下的測定結果

表9 酶切后-25℃保存條件下的測定結果

后期，我們將嘗試使用上述3種內切酶混合的方式對抗體進行酶切處理，期望在HPLC-肽圖的結果上所有6個CDR區(qū)的氨基酸序列與對應的特征峰覆蓋率達到100%。

4 結論

本研究建立了HPLC-肽圖法用于抗CD52單抗生產中的鑒別試驗。該方法經驗證具有良好的專屬性、精密度及耐用性，酶解后樣品能保證一定的穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的質譜法相比，此方法不需要解譜及繁瑣的數(shù)據(jù)處理，僅需比對特征峰的保留時間及峰面積，簡化了實驗操作。可用于單抗的日常質量控制及批檢驗放行中。