侯嵐菲 楊洪 鄧治 代龍軍 門中華 李德軍

（1. 包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，包頭 014030；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室/海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室，儋州 571737）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于亞馬遜河流域，是2 000多種產(chǎn)膠植物中唯一商業(yè)化種植收獲膠乳（天然橡膠原料）的植物。天然橡膠作為四大工業(yè)原料之一，是關(guān)系國計民生的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)和重要戰(zhàn)略物資。我國天然橡膠供需矛盾日益凸顯，自2009年以來自給率已不足20%。我國屬非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹在生長周期內(nèi)不可避免會受低溫、臺風(fēng)、季節(jié)性干旱、病蟲害等逆境條件影響。作為橡膠樹生長環(huán)境中的重要影響因子，逆境脅迫必然對橡膠樹的生長、發(fā)育和膠乳代謝等造成影響［1-4］。因此，如何有效提高橡膠樹對逆境脅迫的耐受性，是橡膠樹研究領(lǐng)域中重要且有潛在應(yīng)用前景的課題。

多胺（Polyamines，PAs）是一類具有強生物活性的低分子脂肪族含氮堿，它可調(diào)節(jié)植物胚胎發(fā)生、根莖生長和衰老、花發(fā)育和果實成熟等生理過程［5-8］。PAs生 物 合 成 起 始 于 腐 胺（Putrescine，Put），在由精氨酸脫羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）和鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）催化的2條Put合成途徑中［9］，已報道的多數(shù)植物中以ADC合成途徑為主。ADC是一種依賴于吡哆醛-5'-磷酸（Pyridoxal 5'-phosphate，PLP）的酶［10］，作為PAs合成的重要酶，ADC在調(diào)控PAs動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，同時ADC還與植物的抗逆相關(guān)。繼燕麥中克隆ADC基因后［11］，又相繼從蘋果、水稻、桃、棉花、顛茄等物種中克隆和鑒定出［12-16］。ADC基因表達一般無組織特異性，它通過調(diào)節(jié)PAs代謝參與植物抗逆反應(yīng)。酸脅迫下大豆ADC活性增加，并與ADCmRNA水平呈正相關(guān)［17］。在水稻中過表達曼陀羅ADC基因可提高Spd和Spm水平，進而增強水稻抗旱性［18］。在金柑中，轉(zhuǎn)錄因子FcWRKY70通過調(diào)控ADC基因表達水平來調(diào)節(jié)Put合成，以此增強植株抗旱性［19］，ADC基因的表達調(diào)控PAs的水平，增強杜梨抗旱性［20］。脅迫誘導(dǎo)的AtADC2調(diào)節(jié)植株體內(nèi)Put積累，從而增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和耐鹽性，AtADC2突變體對鹽敏感需外施Put緩解［21-22］。ADC與枳ICE1相互作用調(diào)節(jié)PAs水平增強抗寒能力［23］。提高小麥中依賴ADC的Put含量從而降低根細胞壁的鋁殘留率，增強小麥植株的耐鋁性［24］。除與非生物逆境反應(yīng)相關(guān)外，ADC基因還參與細胞凋亡、抗病和防御反應(yīng)。胡椒ADC1通過調(diào)節(jié)PAs和γ-氨基丁酸代謝調(diào)控細胞凋亡和防御反應(yīng)［25］。擬南芥ADC基因參與植株對抗黃綠假單胞菌的反應(yīng)［26］。柑橘中過表達枳PtADC導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化，氣孔密度降低，并極顯著地提高了植株對潰瘍病的抗性［27］。

鑒于PAs代謝重要基因—ADC在進化和功能上的保守性，推測其可能在橡膠樹逆境脅迫耐受性中發(fā)揮重要作用。本實驗克隆了一個橡膠樹ADC基因、研究了其表達模式，為深入解析該基因在橡膠樹中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用橡膠樹的組織樣品（雄花、雌花、莖尖、樹皮、膠乳和葉片）、不同發(fā)育時期葉片、過氧化氫（H2O2）、傷害及乙烯利（Ethephon，ET）處理的膠乳樣品，均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗農(nóng)場定植的橡膠樹品系熱研7-33-97。低溫、干旱、高鹽脅迫處理取材為移栽6個月且長勢基本一致的熱研7-33-97組培苗葉片。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選取長勢基本一致的未開割熱研7-33-97進行創(chuàng)傷、H2O2、ET處理，以不作任何處理的未開割樹為對照。每個處理時間點取3次重復(fù)，每次重復(fù)取樣5棵樹，采集的膠乳在液氮中速凍并保存，用于后續(xù)RNA提取。參考Hao等［28］方法，用1%的ET涂于割線及其上方約2 cm割面處，并采集處理0、4、8、24、48及72 h后的膠乳。傷害和H2O2處理參考Zhu等［29］和 Tang等［30］的方法，將2% H2O2浸泡的棉花包在割線及其上方約2 cm割面處，采集處理0、6、24及48 h后的膠乳，用于提取RNA。對橡膠樹品系熱研7-33-97組培苗進行低溫、干旱、高鹽脅迫處理，洗凈組培苗根部泥土并放入清水中，在溫度為30℃、濕度為80%、光照12 h（光照強度 480 μmol·m-2·s-2）及黑暗 12 h環(huán)境中靜置培養(yǎng)2-3 d，隨后進行脅迫處理。參考安澤偉等［31］方法進行低溫（4℃）處理，參考劉輝等［32］方法進行干旱及高鹽脅迫處理，干旱和高鹽脅迫條件分別用30% PEG 6000及1 mol/L NaCl，采集處理0、3、24及48 h后的葉片并立刻用液氮凍存提取RNA。

1.2.2 總RNA提取、cDNA合成和基因克隆 樣品總RNA提取用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的通用植物總RNA提取試劑盒，提取方法參照說明書。用分光光度法進行定量檢測，用瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測。樣品cDNA合成操作參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明。

根據(jù)橡膠樹割面干涸機制實驗室獲得的部分橡膠樹ADC基因序列設(shè)計特異性引物（F：5'-GCATA G A A C A A A G G C A C C A A T T G-3'和R：5'-GCATAGA-ACAAAGGCACCAATTG-3'）擴增橡膠樹ADC基因，并通過測序獲得基因序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 開放閱讀框預(yù)測用NCBI的ORF fi nder；蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；用 Smart分 析 蛋 白保守結(jié)構(gòu)域（http://smart.emblheidelberg.de/）；用Expasy網(wǎng)站的Prot-Param程序分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)（http://web.expasy.org/protparam/）；同源性分析用NCBI中的BLAST和DNASTAR軟件；信號肽預(yù)測用SignalP 4.1 Server軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；用TMHMM 2.0程序預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；通過在線工具Psort分析目的序列的亞細胞定位（https://www.genscript.com/psort.html）。 用 ClustalX 1.8及MEGA 5.1做多序列比對并構(gòu)建進化樹［33］。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據(jù)HbADC1序列設(shè)計特異性熒光定量引物（F：5'-GGTTTATACTATGGCAACGAG-3' 和 R：5'-GCACAAAACCAACCATACACG-3'），以不同樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋5倍后作為模板，反應(yīng)體系為模板2 μL、正反向引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL 及 ddH2O 6 μL。內(nèi) 參為橡膠樹18S rRNA（F：5'-GCTCGAAGAC G A T C A G A T A C C-3'和 R：5'-TTCAGCCTTGCGACC-ATAC-3'）。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，基因相對表達量用2-ΔΔCt法計算。用Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理并作圖，相對表達量結(jié)果為3次重復(fù)的x-±s。

2 結(jié)果

2.1 HbADC1的克隆及序列分析

在分析橡膠樹轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)一條與植物ADC基因高度一致的序列（TSA接受號：GDFU01108758）。根據(jù)該序列設(shè)計特異性引物，以橡膠樹cDNA為模板進行PCR。擴增產(chǎn)物切膠回收并連接到pMD18-T載體，挑選陽性克隆PCR擴增驗證后進行測序。測序結(jié)果（圖1）表明，該序列長2 594 bp且包含完整ORF，經(jīng)Blastx比對，確定該基因為植物ADC家族成員，并命名為HbADC1。HbA-DC1最長開放閱讀框2 175 bp，編碼724個氨基酸。

2.2 HbADC1的生物信息學(xué)分析

HbADC1預(yù)測理論分子量約為77.7 kD，理論等電點為5.14。HbADC1第119-687位為ADC保守結(jié)構(gòu)域，第130-404位和第436-604位殘基分別為鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸和相關(guān)底物的結(jié)合位點，屬于2-磷酸吡哆醛依賴性的Ⅳ型（鳥氨酸/二氨基庚二酸/精氨酸）ADC家族［37］。信號肽預(yù)測結(jié)果（圖2）顯示，HbADC1無信號肽。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明該蛋白屬葉綠體運輸肽、線粒體靶肽和分泌途徑信號肽外的其他類蛋白。

為分析HbADC1與其他植物ADC蛋白的進化關(guān)系，通過ClustalX 1.8和MEGA 5.1軟件，用N-J（neighbor-joining）法進行1 000次Bootstrap構(gòu)建橡膠樹（Hevea brasiliensis）、木薯（Manihot esculenta）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）、毛白楊（Populus trichocarpa）、蘋果（Malus domestica）、棗樹（Zizyphus jujuba）、煙草（Nicotiana tabacum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、可可（Erythroxylum coca）、 水 稻（Oryza sativa）、 玉 米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）ADC蛋白系統(tǒng)進化樹。結(jié)果（圖3）表明，HbADC1與木薯 ADC（XP_021610770.1）、麻風(fēng)樹ADC（XP_012084432.1）蛋白為一個分支，與玉米、水稻和小麥等ADC蛋白屬不同分支，暗示HbADC1與木薯和麻風(fēng)樹ADC蛋白親緣關(guān)系較近，而與玉米、水稻和小麥等ADC蛋白親緣關(guān)系較遠。

2.3 HbADC1的表達分析

圖1 HbADC1核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 HbADC1同源蛋白序列比對

以橡膠樹18S rRNA作為內(nèi)參，對不同組織、不同發(fā)育時期葉片、逆境脅迫和乙烯處理條件下的HbADC1表達模式進行實時熒光定量PCR分析。

2.3.1HbADC1在不同組織及葉片不同發(fā)育時期的表達分析 實時熒光定量PCR結(jié)果（圖4）表明，HbADC1在橡膠樹不同組織（葉片、雌花、雄花、樹皮、膠乳、莖尖）中均有表達，雌花中表達最高，接下來是莖尖、雌花、葉片、樹皮和膠乳。

HbADC1在葉片不同發(fā)育時期表達存在差異，淡綠期表達量遠高于其他4個時期，古銅期、變色期和衰老期表達量相當(dāng)，穩(wěn)定期表達量最低（圖5）。

2.3.2HbADC1在不同逆境處理條件下的表達分析與其他植物ADC基因在逆境條件下表達模式一致，低溫、干旱、傷害、高鹽及H2O2處理均能調(diào)控HbADC1表達，各處理HbADC1表達模式各異。

低溫脅迫下，HbADC1表達呈現(xiàn)先微降后顯著上升模式（圖6-A）。干旱處理后，HbADC1表達水整體呈升高趨勢，24 h持續(xù)上調(diào)并在48 h保持平穩(wěn)（圖6-B）。傷害處理，HbADC1表達先上升，后下降再上升，處理后24 h和48 h表達水平均低于處理前水平（圖6-C）。HbADC1的表達受高鹽脅迫調(diào)控，HbADC1表達在高鹽脅迫后先下降，隨后上升并在24 h達到最高后又下降（圖6-D）。HbADC1的表達還受H2O2誘導(dǎo)，處理后的表達水平先升后降，表達最高和最低點分別出現(xiàn)在6和48 h（圖6-E）。綜合HbADC1在逆境條件下表達模式，推測HbADC1參與橡膠樹多種逆境脅迫反應(yīng)，并在其中發(fā)揮重要作用。

圖3 HbADC1與其他植物ADC蛋白的系統(tǒng)進化分析

圖4 不同組織中HbADC1的表達

圖5 葉片不同發(fā)育時期HbADC1的表達

2.3.3HbADC1在乙烯處理下的表達分析 ET是橡膠樹中研究最深入且應(yīng)用最廣的植物激素，作為橡膠樹增產(chǎn)刺激劑，ET通過延長排膠時間提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量。實時熒光定量PCR結(jié)果（圖7）顯示HbADC1表達受ET調(diào)控。ET處理后HbADC1表達存在波動，呈先升后降再升模式，但整體呈上升趨勢，處理后各時間點表達量均高于處理前，8 h達到表達高峰，上述結(jié)果暗示HbADC1參與橡膠樹ET反應(yīng)。

圖6 不同脅迫下HbADC1的表達

圖7 ET處理下HbADC1的表達

3 討論

ADC是PAs合成途徑中一種依賴于PLP的重要酶。本研究克隆了一個橡膠樹的ADC基因，HbADC1序列長2 594 bp，最長ORF序列長2 175 bp，編碼724個氨基酸。與其他植物ADC蛋白一致，HbADC1包含ADC保守結(jié)構(gòu)域，具有鳥氨酸/賴氨酸/精氨酸和相關(guān)底物的結(jié)合位點，屬于2-磷酸吡哆醛依賴性的Ⅳ型ADC家族［34］，與已鑒定的植物ADC蛋白相同［12，22］。以上結(jié)構(gòu)域和特征對ADC蛋白行使功能至關(guān)重要，推測HbADC1具有ADC蛋白活性，可行使ADC蛋白功能。擬南芥AtADC1和AtADC2在細胞質(zhì)和葉綠體中均表現(xiàn)出雙重亞細胞定位［35］，與此不同，亞細胞定位預(yù)測HbADC1不定位于葉綠體，屬其他類蛋白。當(dāng)然，HbADC1亞細胞定位預(yù)測結(jié)果還有待于進一步實驗確認。橡膠樹屬大戟科，進化分析顯示HbADC1與大戟科植物木薯、麻風(fēng)樹等ADC蛋白為同一分支，與玉米、小麥和水稻等ADC蛋白屬不同分支，表明其與大戟科植物木薯、麻風(fēng)樹等ADC蛋白親緣關(guān)系較近。上述結(jié)果與傳統(tǒng)分類一致，暗示HbADC1與上述植物ADC蛋白功能相似。

本研究發(fā)現(xiàn)HbADC1表達無組織特異性，該結(jié)果與其他植物ADC基因組織表達模式相似，如桃樹ADC基因在根和老葉中表達量最低，在嫩枝和幼葉中的表達高于花和莖［14］；棉花ADC基因在葉片的表達量遠高于根和莖，在根中表達量最低［16］；芥菜ADC基因主要在根和莖中表達，在葉片中幾乎不表達［36］；AtADC1為組成型表達，而AtADC2僅在蓮座葉和角果中表達［37］。此外，HbADC1在橡膠樹葉片淡綠期表達遠高于其他4個時期，暗示HbADC1與橡膠樹葉片發(fā)育密切相關(guān)。

植物ADC活性調(diào)節(jié)依賴于生理條件，且與多種非生物脅迫有關(guān)［18-21，23-25，27］。擬南芥中 ADC 活性低會減少PAs合成，從而降低植株耐鹽性［38］。PbrMYB21在煙草中過表達使ADC表達上升，PAs積累增強了煙草對脫水和干旱脅迫的耐受性［20］；擬南芥和芥菜中ADC活性分別受滲透脅迫和鹽脅迫調(diào)控［36，39］；AtADC2在細菌侵染后表達上升，蛋白活性增加［26］。與上述結(jié)果相似，本研究中HbADC1表達受干旱、低溫、傷害、高鹽和H2O2等逆境脅迫調(diào)控，表明HbADC1可能參與巴西橡膠樹逆境脅迫反應(yīng)。ET通過延長排膠時間提高膠乳產(chǎn)量［40］。本研究發(fā)現(xiàn)，ET處理后HbADC1表達存在波動，但整體呈上升趨勢，暗示其可能參與橡膠樹ET反應(yīng)和產(chǎn)排膠過程。

4 結(jié)論

克隆獲得橡膠樹HbADC1。其蛋白屬于2-磷酸吡哆醛依賴性的Ⅳ型ADC家族，與大戟科植物木薯、麻風(fēng)樹ADC聚為一支。HbADC1無組織特異性表達。HbADC1可能參與橡膠樹的葉片發(fā)育過程及橡膠樹逆境脅迫和乙烯應(yīng)答過程。