盧佳 鄧秋萍 任文華

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210046）

瑞典科學(xué)家Boman在研究巨型蠶蛾Hyalophora cecropia滯育蛹的誘導(dǎo)型防御系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的多肽即抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）［1］，隨后科學(xué)家相繼在微生物、昆蟲、植物和人體中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽［2］。目前已發(fā)現(xiàn) 2 600多種抗菌肽［3］，廣泛分布于病毒、細(xì)菌、真菌及各類動(dòng)物體內(nèi)?？咕膶儆诳股氐囊粋€(gè)新的家族，可作為常規(guī)抗生素治療藥物，也可與抗生素協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。研究表明，兩種或幾種抗菌肽、抑或抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)用，可以拓寬抗生素的抗菌譜乃至增強(qiáng)治療效果［4］。它不僅可以作用于細(xì)菌、真菌，對(duì)病毒和癌細(xì)胞也有抑制作用，具有廣譜的抗菌活性［5］。此外，抗菌肽還可以有效地殺滅引起人類及動(dòng)物寄生蟲?。ㄈ绡懠?、氏病、菜什曼病等）的寄生蟲，并且具有抗精子作用、神經(jīng)毒性、調(diào)節(jié)細(xì)菌以及在LDS或LPS協(xié)同作用下，增強(qiáng)人和鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)等生物學(xué)功能。

與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽的抗菌作用主要有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）抗菌譜廣：對(duì)革蘭氏陰性菌［6-7］、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏兼性菌和真菌［7-9］都有高效的殺菌作用；（2）作用專一：原核細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不同，可以選擇性地作用于原核細(xì)胞和癌細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎無(wú)作用；（3）殺菌快速：大多數(shù)抗菌肽都可在5 min內(nèi)引起菌類細(xì)胞的死亡；（4）不易產(chǎn)生抗藥性：對(duì)抗菌肽的抗藥性起決定性作用的因素系其疏水性和兩親性，而非肽鏈長(zhǎng)度和所攜電荷數(shù)，這種特殊的作用機(jī)制使得致病菌很難產(chǎn)生抗藥性或交叉抗性［10］；（5）不易蓄積中毒；（6）無(wú)致畸作用。

目前，公認(rèn)的抗菌肽的作用機(jī)制有兩種：膜作用機(jī)制，即破壞細(xì)胞膜，造成膜穿孔；非膜作用機(jī)制，又可分為細(xì)胞外機(jī)制和細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，細(xì)胞外機(jī)制主要指抗菌肽抑制細(xì)胞壁合成、激活自溶素或磷脂酶而發(fā)生溶菌作用［11］，細(xì)胞內(nèi)機(jī)制則與干擾真核生物線粒體功能的發(fā)揮，影響核糖體合成蛋白質(zhì)，影響基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和調(diào)控有關(guān)。陳旋等［12］研究了抗菌肽P7對(duì)大腸桿菌的非膜作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，抗菌肽P7可造成DNA的損傷，使DNA復(fù)制相關(guān)基因下調(diào)、DNA損傷修復(fù)基因上調(diào)，抑制DNA的復(fù)制和RNA的合成。

人類許多疾病的治療得益于抗生素的發(fā)現(xiàn)和臨床使用，但近40年以來(lái)，新型抗生素僅發(fā)現(xiàn)了3種［13］，而隨著抗生素的濫用，耐藥細(xì)菌感染已成威脅人類健康的一大隱患?？咕目咕钚愿?、抗菌譜廣［14］、種類多、不易引發(fā)細(xì)菌的耐藥性及對(duì)宿主無(wú)毒性或毒性小等特征，使其有望開發(fā)為新型的抗菌藥物。天然抗菌肽經(jīng)過(guò)人工改造可降低細(xì)胞毒性、增強(qiáng)抗菌性和穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)而造福人類具有重要意義［15］。以腸道菌群和抗菌肽間的相互作用為基礎(chǔ)，通過(guò)監(jiān)測(cè)抗菌肽表達(dá)水平的方式建立起的一種疾病預(yù)防和診斷治療的輔助手段，可用來(lái)預(yù)估機(jī)體腸道的健康狀態(tài)［16］。此外，抗菌肽在防控動(dòng)物疫病、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫水平和抗氧化能力、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等方面也具有廣闊的開發(fā)利用前景［17］。

蜈蚣（Centipede）是地球上最古老的捕食動(dòng)物之一，屬于節(jié)肢動(dòng)物門唇足綱整形目蜈蚣科蟲體。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》所載，蜈蚣具有熄風(fēng)止痙，通絡(luò)止痛和攻毒散結(jié)的作用，而且在治療癌癥、肝炎、腦血管病及多種皮膚病等均有明顯的療效。研究發(fā)現(xiàn)，少棘蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）的毒液具有多種生化和生理作用［18-19］。Peng等［20］從少棘蜈蚣毒液中分離得到兩種抗菌肽，命名為Scolopin 1 和 Scolopin 2。其中，Scolopin 2經(jīng)酰胺化修飾獲得的Scolopin-2-NH2（S-2-N），具有比其母體肽Scolopin-2（S-2）更強(qiáng)的抗菌活性，但對(duì)抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌機(jī)理尚未知曉。因此，本論文對(duì)抗菌肽S-2-N和S-2的抗菌活性、理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，并從細(xì)胞水平和分子水平對(duì)其抗菌機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌肽及菌種 抗菌肽：Scolopin-2（S-2）：GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSH；Scolopin-2-NH2（S-2-N）：GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSHNH2；均由吉爾生化（上海）有限公司合成，自動(dòng)多肽合成儀 APEX396，通過(guò) HPLC 液相色譜進(jìn)行脫鹽、純化，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，純度≥95%。菌種：大腸桿菌（E.coliK12D31）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（salmonella）和枯草桿菌（Bacillus subtilis）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 抗生素Kan+、Amp+購(gòu)自Amresco公司；AnnexinV-FITC/PI 雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京 Vazyme 公司；DAPI 染色液購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、通用型基因組DNA提取試劑盒（MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit） 購(gòu) 于 TaKaRa 生 物 公 司 ；SYBR?Premix Ex TaqTMII染料購(gòu)于南京羅氏生物公司；RNA提取試劑盒（TranZolTMUp Plus RNA Kit，ER501）購(gòu)于南京TransGen Biotech公司；細(xì)胞周期試劑盒（KGA512）購(gòu)于凱基生物公司。

1.1.3 儀器 ELx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BLO-TEK公司）、320-SpH計(jì)（Mettler Toledo公司）、圓二色譜儀（英國(guó)Chirascan，Applied Photophysics）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、PTC-200 PCR儀（美國(guó)MJ Research公司）、核酸與蛋白分析儀（美國(guó)NanoDropND-1000），StepOnePlusTMReal-Time PCR System（美國(guó) AB生物系統(tǒng)公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽Scolopin-2-NH2的抗菌活性及理化性質(zhì)

1.2.1.1 抗菌肽的抗菌活性及最小抑菌濃度 配置LB培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0。分別將凍存的4種菌（大腸桿菌K12D31、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草桿菌）按 1∶100 接種到液體 LB 培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過(guò)夜。

將固體 LB 培養(yǎng)基融化并冷卻至 55℃左右，按1∶100 加入菌液并搖勻，倒入滅菌平板培養(yǎng)皿，9 mL /皿，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)冷卻至凝固。用滅菌的打孔器在帶菌的固體 LB平板上打孔，孔徑為 8 mm，分別加入20 μmol/L抗菌肽S-2/S-2-N于瓊脂孔內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)10 h，拍照。

按最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）測(cè)定法檢測(cè)抗菌肽S-2/S-2-N對(duì)4種菌株（大腸桿菌K12D31、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草桿菌）的抗菌活性，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，與初始OD值相比，OD值尚未顯著變化的最小濃度定義為此抗菌肽對(duì)該菌的最小抑菌濃度。

1.2.1.2 抗菌肽的理化性質(zhì) 以圓二色譜儀檢測(cè)抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)用Orign 8軟件處理作圖。

檢測(cè)抗菌肽的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、離子強(qiáng)度穩(wěn)定性及對(duì)消化酶的不敏感性。將抗菌肽樣品分別經(jīng)下述條件處理：溫度（100℃水浴0 min、5 min、10 min、20 min、30 min）、pH磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 梯 度 為 1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 和 12.0）、NaCl、KCl、CaCl2（離子濃度分別為 0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L）、胰蛋白酶和胃蛋白酶（37℃處理0 min、30 min和60 min），加入帶菌（E.coliK12D31）的LB平板瓊脂孔里，37℃培養(yǎng) 10 h，量取抑菌圈直徑。

1.2.2 抗菌肽Scolopin-2-NH2對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的影響

1.2.2.1 抗菌肽在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的定位 熒光標(biāo)記S-2/S-2-N。將活化的E.coliK12D31培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（105），5 000 r/min離心5 min收集菌液；PBS洗3次后加入FITC-S-2/S-2-N（10 μmol/L）37℃避光培養(yǎng) 30 min和1 h；PBS洗3次，5 000 r/min，離心5 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2.2 觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)、分析細(xì)胞膜完整性及抗菌肽的穿膜效率 將活化的E.coliK12D31培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD=0.5），離心收集菌液，加入抗菌肽S-2/S-2-N（20 μmol/L）37℃培養(yǎng) 30 min和 2 h，陰性對(duì)照為PBS；以此為材料制備超薄切片，透射電鏡下觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)。

在帶有抗菌肽的E.coliK12D31中加入PI溶液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI著染陽(yáng)性細(xì)菌數(shù)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC-S-2/S-2-N處理后的E.coliK12D31著染的陽(yáng)性細(xì)菌數(shù)。

1.2.3 抗菌肽Scolopin-2-NH2對(duì)細(xì)菌DNA和RNA的作用研究

1.2.3.1 細(xì)菌基因組DNA、總RNA含量的檢測(cè) 酶標(biāo)儀測(cè)定經(jīng)S-2/S-2-N處理的E.coliK12D31的基因組DNA和RNA的熒光強(qiáng)度。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3.2 抗菌肽與細(xì)菌DNA/RNA的凝膠阻滯分析 參照試劑盒提取法提取E.coliK12D31基因組DNA。分別用S-2/S-2-N溶于DNA binding buffer并作梯度稀釋，加入到細(xì)菌DNA溶液中，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像觀察拍照。同上法進(jìn)行抗菌肽與細(xì)菌RNA的凝膠阻滯分析。

1.2.3.3 抗菌肽結(jié)合DNA后的結(jié)構(gòu)變化 在E.coliK12D31基因組DNA中加入S-2/S-2-N，制成樣品。圓二色譜儀掃描，每個(gè)樣品連續(xù)掃描3次，取平均值；數(shù)據(jù)用Orign 8軟件處理。

1.2.3.4 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞周期及細(xì)菌DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的影響 將活化的E.coliK12D31培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入S-2/S-2-N，37℃分別培養(yǎng)0.5h后，加入PI染色液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

取上述培養(yǎng)菌體進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA（表1）。

用羅氏Green qPCR Master Mix 試劑盒對(duì)dnaA、dnaB、dnaG、SSB、RecA和RecN基因進(jìn)行RT-PCR分析。按表3加入20 μL RT-PCR反應(yīng)體系所需的各種試劑于八聯(lián)管中。引物序列如表2所示，進(jìn)行RT-PCR。

1.2.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，（*）P＜0.05為具有顯著差異。

表1 cDNA合成反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽Scolopin-2-NH2的抗菌活性及理化性質(zhì)

2.1.1 抗菌活性檢測(cè)及最小抑菌濃度（MIC）兩種抗菌肽的最小抑菌濃度（MIC）見表4?？梢钥闯鲺０坊揎椀腁MP-S-2-N的抑菌活性明顯強(qiáng)于其母肽AMP-S-2，且二者對(duì)E.coliK12D31的抑菌效果最佳，故可選擇大腸桿菌作為抗菌敏感菌株。

表2 RT-PCR引物序列

2.1.2 抗菌肽的理化性質(zhì) 圓二色譜技術(shù)探究抗菌肽S-2/S-2-N的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖1顯示的，二者均在197 nm處有一個(gè)負(fù)峰，說(shuō)明具有一個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。AMP-S-2的峰值為-15.52，而AMP-S-2-N的峰值為-12.60，負(fù)峰值降低，即峰有所上移，這可能與S-2-N比S-2具有更強(qiáng)的抗菌活性有關(guān)。

表3 Real-time PCR反應(yīng)體系

表4 抗菌肽的最小抑菌濃度

圖1 抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

如圖2-A所示，沸水浴5、10、20 min后，S-2/S-2-N仍具有較好的抗菌活性，30 min后抑菌圈直徑有所減小。說(shuō)明抗菌肽對(duì)高溫具有較強(qiáng)的耐受性，僅在溫度超過(guò)30 min時(shí)，抑菌能力才有所下降。

如圖2-B，pH為 1、3、5、10、12時(shí)與pH為7時(shí)的抑菌圈大小無(wú)明顯差別。這暗示了AMP-S-2/S-2-N 具有酸堿耐受性。

如圖2-C（S-2）和2-D（S-2-N）顯示，除了Ca2+對(duì)AMP-S-2-N有輕微的抑制作用外，不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2離子對(duì)抗菌肽的抑制作用不明顯。說(shuō)明抗菌肽對(duì)Na+和K+離子的耐受力較強(qiáng)，而Ca2+可能對(duì)其抗菌活性有一定的影響。

抗菌肽經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶37℃酶切處理后，由圖2-E（胰蛋白酶處理）與圖2-F（胃蛋白酶）發(fā)現(xiàn)，處理60 min的實(shí)驗(yàn)組抑菌圈直徑大小與陰性對(duì)照組沒有明顯變化，表明AMP-S-2/S-2-N對(duì)這兩種消化酶具有一定的耐受力。

2.2 抗菌肽Scolopin-2-NH2對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的影響

2.2.1 抗菌肽在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的定位 如圖3所示，經(jīng)FITC-S-2/S-2-N處理后的細(xì)胞均帶有熒光，說(shuō)明S-2/S-2-N已完全進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生變化，說(shuō)明S-2/S-2-N的作用靶點(diǎn)應(yīng)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。處理2 h后，觀察到抗菌肽進(jìn)入的細(xì)胞數(shù)增多，且經(jīng)S-2-N處理后的細(xì)胞有少量細(xì)胞碎片。

2.2.2 觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)、分析細(xì)胞膜完整性及抗菌肽的穿膜效率 如圖4，AMP-S-2/S-2-N處理20min后，E.coliK12D31細(xì)胞膜邊緣出現(xiàn)輕微的模糊，細(xì)菌的形態(tài)還比較完整；2 h后，S-2處理的細(xì)胞的細(xì)胞膜開始破裂，內(nèi)容物開始釋放出來(lái)，但形態(tài)還可以看清；而經(jīng)S-2-N處理的細(xì)胞內(nèi)容物泄露呈彌散狀，整個(gè)細(xì)胞已基本瓦解破裂。因此推斷，AMPS-2-/S-2-N作用細(xì)菌2 h后導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的破裂。

如圖 5 所示，處理20 min后，10 μmol/L S-2使PI著染陽(yáng)性細(xì)胞比例為4.10%，而經(jīng)10 μmol/L S-2-N處理后染陽(yáng)性細(xì)胞比例為4.96%。當(dāng)處理濃度增大到20 μmol/L時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為7.48%和8.82%。考慮到背景干擾，這樣的結(jié)果暗示了S-2/S-2-N對(duì)細(xì)菌胞膜有輕微的破壞作用，雖然在MIC時(shí)，S-2/S-2-N并沒有破壞細(xì)胞膜，影響質(zhì)膜的完整性，但濃度增大破壞性增強(qiáng)，且S-2-N對(duì)細(xì)胞膜的擾動(dòng)總比S-2強(qiáng)一些。

如圖6所示，經(jīng)10 μmol/L的S-2/S-2-N處理20 min后，有41.28%的大腸桿菌細(xì)胞被S-2侵入，而S-2-N則為43.05%，均高于PBS陰性對(duì)照組（0.08%）；當(dāng)S-2-N濃度為20 μmol/L時(shí)，同樣處理20 min，陽(yáng)性細(xì)胞比例為54.97%高于S-2（44.83%）。以上結(jié)果暗示了S-2-N穿透E.coliK12D31細(xì)胞膜的效率比親本（S-2）高，這可能也是酰胺化的S-2-N比其親本抗菌活性強(qiáng)的原因之一。

圖2 抗菌肽的穩(wěn)定性

2.3 抗菌肽Scolopin-2-NH2對(duì)細(xì)菌DNA和RNA的作用研究

2.3.1 細(xì)菌基因組DNA、總RNA含量的檢測(cè) 如圖7顯示，S-2/S-2-N分別作用5 h后，與對(duì)照組相比，S-2-N組DNA合成量減少了36%（P＜0.05），而S-2組為22%；RNA合成量也減少了33%，而S-2組為20%。結(jié)果表明S-2/S-2-N均可抑制大腸桿菌核酸的合成，且S-2-N抑菌能力強(qiáng)于母體肽S-2。

2.3.2 抗菌肽與細(xì)菌DNA/RNA的凝膠阻滯分析 通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMP-S-2/S-2-N與基因組DNA具有很強(qiáng)的結(jié)合力。如圖8所示，當(dāng)S-2濃度為10.4 μmol/L時(shí)，即開始出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，當(dāng)濃度達(dá)到13.0 μmol/L時(shí)，S-2與NDA已經(jīng)強(qiáng)烈結(jié)合，使DNA無(wú)法跑出點(diǎn)樣孔，即已被完全阻滯。而當(dāng)S-2-N為10.4 μmol/L時(shí)，已經(jīng)將DNA阻滯在點(diǎn)樣孔里，隨著濃度的增大，S-2-N與DNA結(jié)合的程度使得gold view已經(jīng)無(wú)法插入到DNA的堿基對(duì)中，使得點(diǎn)樣孔中的DNA沒有發(fā)出熒光。以上現(xiàn)象暗示了這兩個(gè)抗菌肽中，至少S-2-N，與DNA結(jié)合的方式可能與gold view插入DNA的方式類似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅說(shuō)明了AMP-S-2/S-2-N能與DNA強(qiáng)烈結(jié)合，而且S-2-N結(jié)合DNA的能力比S-2強(qiáng)。

圖3 激光共聚焦觀察 FITC-S-2/S-2-N處理過(guò)的大腸桿菌細(xì)胞

圖4 大腸桿菌經(jīng)S-2/S-2-N處理后的電鏡圖

圖5 流式細(xì)胞儀分析PI流入抗菌肽處理的大腸桿菌細(xì)胞的結(jié)果

在抗菌肽與RNA的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中，如圖9所示（圖中拖尾現(xiàn)象可能是在提取過(guò)程中RNA部分降解，但主條帶仍保持完好），S-2/S-2-N可與RNA強(qiáng)烈結(jié)合，當(dāng)S-2為15.6 μmol/L時(shí)，RNA就出現(xiàn)了阻滯現(xiàn)象，當(dāng)濃度達(dá)到62.5 μmol/L時(shí)已基本被阻滯在點(diǎn)樣孔里；對(duì)S-2-N來(lái)說(shuō)，濃度為7.8 μmol/L時(shí)，就開始有明顯的阻滯現(xiàn)象，當(dāng)濃度大于15.6 μmol/L時(shí)，RNA已經(jīng)完全跑不出點(diǎn)樣孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明S-2-N結(jié)合RNA的能力比S-2強(qiáng)。

圖6 流式細(xì)胞儀分析FITC-抗菌肽流入大腸桿菌細(xì)胞的結(jié)果

圖7 S-2/S-2-N對(duì)大腸桿菌核酸合成的影響

2.3.3 抗菌肽結(jié)合DNA后的結(jié)構(gòu)變化 如圖10所示，在DNA的CD譜中，270 nm的正峰是由于堿基堆積作用產(chǎn)生的，240 nm的負(fù)峰則對(duì)應(yīng)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的B型構(gòu)象。AMP-S-2-N/S-2的加入都使DNA的正峰和負(fù)峰強(qiáng)度都降低了，且S-2-N使負(fù)峰降低強(qiáng)度更大，說(shuō)明二者都使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)變得松散，也消弱了DNA堿基對(duì)之間的π-π堆積作用；圖中DNA的CD譜峰位未發(fā)生紅移（即左右平移），說(shuō)明二者只影響了DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，沒有引起雙螺旋的解旋。該結(jié)果暗示了AMP-S-2-N與DNA發(fā)生了堿基嵌插或溝槽作用。

2.3.4 抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞周期及細(xì)菌DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的影響 凝膠阻滯試驗(yàn)和圓二色譜法分析可知，AMP-S-2/S-2-N可以引起DNA結(jié)構(gòu)的變化。DNA是信息傳遞的載體，故DNA的基本功能必定受到影響，因此利用流式細(xì)胞術(shù)分析了抗菌肽對(duì)大腸桿菌細(xì)胞周期的影響。

圖11-A為正常大腸桿菌的細(xì)胞周期圖，處于S期的細(xì)胞數(shù)為18.14%，陽(yáng)性對(duì)照組（Buforin II）進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)為33.10%。經(jīng)S-2/S-2-N處理后，如圖11-B-C所示，處于S期的細(xì)胞數(shù)為23.86%和26.32%，雖然比陽(yáng)性對(duì)照組（Buforin II）稍低，但與對(duì)照組相比有明顯差別（P＜0.05），說(shuō)明S-2和S-2-N可以使細(xì)胞停留于S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。

圖8 抗菌肽S-2（A）和 S-2-N（B）分別與大腸桿菌DNA作用的凝膠阻滯分析

圖9 抗菌肽S-2（A）和 S-2-N（B）分別與大腸桿菌RNA作用的凝膠阻滯分析

如圖12顯示，陽(yáng)性對(duì)照組為Buforin II（5-21）處理，陰性對(duì)照組為PBS處理?；騞naA、dnaB、dnaG和SSB與DNA復(fù)制相關(guān)。在S-2和S-2-N的作用下，基因dnaA在經(jīng)S-2-N處理后表達(dá)水平明顯降低為56.68%（P＜0.05），比陽(yáng)性對(duì)照組62.03%還低；dnaG在實(shí)驗(yàn)組（S-2-N）中，表達(dá)量為66.00%，與陽(yáng)性對(duì)照組64.78%結(jié)果類似；其他基因dnaB和SSB的表達(dá)量也均有一定程度的降低。RecA和RecN是與DNA修復(fù)相關(guān)的基因，與陰性對(duì)照組相比，S-2組為1.17倍和1.08倍，而S-2-N組是1.24倍和1.3倍（P＜0.05），二者的表達(dá)量均有增加，與陽(yáng)性對(duì)照組類似，說(shuō)明S-2/S-2-N都可以損傷DNA，且暗示了S-2-N引起的DNA損傷高于其親本。表明S-2/S-2-N可以影響DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)。

圖10 抗菌肽S-2和S-2-N分別對(duì)大腸桿菌DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

AMP-S-2是一種分離自少棘蜈蚣毒液的陽(yáng)離子肽，具有廣譜的抗菌活性，但并不夠理想。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期對(duì)AMP-S-2進(jìn)行酰胺化改造，獲得了AMP-S-2-N。在此基礎(chǔ)上，本研究首先采用瓊脂糖孔穴法，通過(guò)篩選不同菌種，發(fā)現(xiàn)AMP-S-2和S-2-N對(duì)E.coliK12D31具有較強(qiáng)的抑制作用，且AMPS-2-N比親本具有更強(qiáng)的抑菌活性，最小抑菌濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)也印證了這一點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道，分別來(lái)自豬和牛的抗菌肽PR-39和Indolicidin都具有無(wú)規(guī)則卷曲的松散結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制大分子合成來(lái)發(fā)揮抗菌作用［21］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)圓二色譜儀預(yù)測(cè)AMP-S-2和S-2-N的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者具有無(wú)規(guī)則卷曲的松散結(jié)構(gòu)；且AMPS-2-N的負(fù)峰峰值降低，峰位上移，這可能與其抗菌活性更強(qiáng)的原因之一。

另外，抗菌肽本身也存在著許多亟待解決的問題，如抗菌肽進(jìn)入人體后易被蛋白酶水解，穩(wěn)定性低等在新藥開發(fā)研制中普遍存在。于是，在本文中AMP-S-2和S-2-N在經(jīng)熱、不同pH緩沖液、不同離子強(qiáng)度和不同蛋白酶處理后的，二者均100℃熱的耐受性較強(qiáng)，僅在作用半小時(shí)后抗菌能力才有所下降；對(duì)強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境具有不敏感性；對(duì)不同離子強(qiáng)度也具有一定的耐受力；可抵抗消化酶的消化作用。AMP-S-2和S-2-N的這種對(duì)消化酶的不敏感性，有利于開發(fā)為口服藥，此研究解除了對(duì)抗菌肽易被體內(nèi)蛋白酶水解及穩(wěn)定性低方面的擔(dān)憂。

圖11 抗菌肽對(duì)大腸桿菌細(xì)胞周期的影響

圖12 抗菌肽對(duì)大腸桿菌復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的影響

有研究認(rèn)為，抗菌肽在發(fā)揮抑菌作用時(shí)，首先攻擊的位點(diǎn)是細(xì)胞膜，通過(guò)促使細(xì)胞膜破裂等起到殺死細(xì)菌的作用，例如，抗菌肽Alamethicin主要通過(guò)由3-11個(gè)螺旋桿排列形成跨膜螺旋束或形成桶-板模式使細(xì)胞膜上形成許多孔洞，從而增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性而殺死細(xì)菌［22］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察得知，F(xiàn)ITC綠色熒光可以充滿整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，表明S-2/S-2-N能夠完全進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，且暗示了S-2/S-2-N的作用靶點(diǎn)應(yīng)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

據(jù)報(bào)道，環(huán)形肽可以擾亂磷脂雙分子層形成1-2 nm的環(huán)形孔，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物大量外漏發(fā)揮殺傷作用［23］。通過(guò)電子透射顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，S-2/S-2-N處理細(xì)胞2 h后，大腸桿菌細(xì)胞均有內(nèi)容物流出，且S-2-N可使細(xì)胞達(dá)到基本破裂，甚至瓦解，最后導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

有研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽protegrin-1（PG-1）以一種依靠脂質(zhì)成分的膜相互作用方式來(lái)穿透細(xì)胞膜發(fā)揮殺菌作用［24］。于是，我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了S-2/S-2-N對(duì)大腸桿菌細(xì)胞完整性和穿透效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌菌膜的破壞作用不太強(qiáng)，但二者穿透細(xì)胞膜的效率比較高（即陽(yáng)性細(xì)胞的比例），且S-2-N的穿透效率達(dá)到了54.97%。此結(jié)果正好與透射電鏡所觀察到的結(jié)果一致，均說(shuō)明了AMPS-2-N具有更強(qiáng)的殺菌能力。

大多數(shù)抗菌肽的作用靶點(diǎn)為細(xì)胞膜，通過(guò)破壞或溶解細(xì)胞膜來(lái)達(dá)到殺傷細(xì)菌的效果。而研究發(fā)現(xiàn)有些抗菌肽的作用靶點(diǎn)則位于細(xì)胞內(nèi)，例如，抗菌肽Indolicidin可以誘導(dǎo)大腸桿菌絲化并抑制大腸桿菌DNA的合成［25］。在本實(shí)驗(yàn)中，AMP-S-2-N和AMP-S-2的主要作用部位就是胞內(nèi)的核酸-DNA。從圖7可以看出AMP-S-2-N/S-2都減少了大腸桿菌（K12D31）細(xì)胞中DNA/RNA的含量，即影響了核酸的合成。已報(bào)道，抗菌肽Butorin II穿透大腸桿菌細(xì)胞膜后與DNA和RNA結(jié)合，抑制細(xì)胞功能從而導(dǎo)致細(xì)菌快速死亡；而magainin 2也可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA和RNA結(jié)合，從起到抑菌作用［26-27］。本文通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證明了AMP-S-2-N和AMP-S-2可以不同程度地結(jié)合DNA和RNA，呈濃度梯度依賴性，且AMP-S-2-N結(jié)合DNA的能力強(qiáng)于母體肽。另外，圖9結(jié)果與凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，再次證明了AMP-S-2-N和AMP-S-2與DNA具有親和力，但具體抗菌肽通過(guò)哪種作用力與DNA什么部位結(jié)合需要進(jìn)一步探究。

此外，有些抗菌肽可以抑制DNA復(fù)制相關(guān)的酶，如PR-39［28］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMP-S-2-N 和AMP-S-2不僅能夠影響大腸桿菌的細(xì)胞周期而且對(duì)DNA相關(guān)基因的表達(dá)也有影響。從圖11可以看出，在正常大腸桿菌的細(xì)胞周期圖中，處于S期的細(xì)胞數(shù)為18.14%，S-2/S-2-N處理后，處于S期的細(xì)胞數(shù)為23.86%和26.32%，與陰性對(duì)照組有明顯差異，且與陽(yáng)性對(duì)照組（Buforin II）33.10%結(jié)果類似，說(shuō)明AMP-S-2-N和AMP-S-2抑制了大腸桿菌細(xì)胞周期的進(jìn)行；另外，通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析與大腸桿菌DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，AMPS-2-N和AMP-S-2下調(diào)了基因dnaA、dnaB、dnaG和SSB的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)了RecA和RecN的表達(dá)。

綜上所述，AMP-S-2-N和AMP-S-2 通過(guò)抑制大腸桿菌DNA和RNA合成，能夠結(jié)合DNA和RNA，影響DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞周期和DNA相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑菌的效果。

4 總結(jié)

本研究主要以少棘蜈蚣抗菌肽 Scolopin-2-NH2為研究對(duì)象，對(duì)其抗菌活性、理化性質(zhì)以及在細(xì)胞和分子水平上抗菌機(jī)制的進(jìn)行了探究。得出了以下結(jié)論：（1）抗菌肽Scolopin-2-NH2及其母體肽對(duì)E.coliK12D31具有較強(qiáng)的抗菌活性，且Scolopin-2-NH2強(qiáng)于母體肽；研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽Scolopin-2-NH2和Scolopin-2具有無(wú)規(guī)則卷曲的松散二級(jí)結(jié)構(gòu)，這可能與其抗菌活性有關(guān)；另外，二者對(duì)外界環(huán)境（熱、酸堿、離子、消化酶）具有一定的穩(wěn)定性。（2）從細(xì)胞水平對(duì)抗菌機(jī)制研究表明，抗菌肽 Scolopin-2-NH2及其母體肽不僅可以破壞大腸桿菌胞膜、快速地進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)使細(xì)菌內(nèi)容物泄露，還通過(guò)結(jié)合DNA/RNA及影響DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)達(dá)到抑菌效果。（3）從分子水平對(duì)抗菌機(jī)制研究顯示，抗菌肽Scolopin-2-NH2及其母體肽還可以阻滯大腸桿菌的細(xì)胞周期，抑制DNA復(fù)制相關(guān)基因（dnaA、dnaB、dnaG和SSB）表達(dá)和促進(jìn)DNA修復(fù)相關(guān)基因（RecA和RecN）的表達(dá)來(lái)抑制大腸桿菌的細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗菌作用。