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(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

抗生素對人們生活的影響日益得到重視，除了抗生素不合理使用造成的危害以外，環(huán)境中的抗生素、小劑量抗生素對人體健康的影響都是值得研究的問題[1-3]。腸道菌群是維系人體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在正常情況下，腸道菌群與宿主共同維持微生態(tài)平衡，保護人體的健康。當受到外界因素如飲食狀況、心理壓力、抗生素等影響時，腸道菌的種類和數(shù)量會發(fā)生一系列變化。目前，腸道菌群失調(diào)已被證明與多種疾病有關，如難辨梭狀芽孢桿菌感染、炎癥性腸病、癌癥和2型糖尿病等[4-6]?？股啬軌蝻@著改變腸道微生物菌群結構，從而影響微生物的代謝和腸道健康。有研究表明：抗生素會影響小鼠體內(nèi)的代謝平衡[7]，多黏菌素E灌胃能夠誘導腸道菌群失調(diào)，且導致腸屏障功能損傷和細菌易位[8]。同時,抗生素處理使小鼠腸道腸球菌增殖，改變了相關的腸道菌黏液層，降低了腸壁厚度[9]。

為了進一步揭示抗生素對腸道菌群組成的影響及其作用機制，筆者擬采用經(jīng)典的頭孢曲松鈉造成抗生素相關性菌群失調(diào)模型，研究抗生素對腸道菌群組成及相關代謝的影響，為抗生素對機體代謝的影響研究提供參考，以期為評價抗生素對機體的副作用及抗生素用后的修復等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

20 只SPF級 BALB/c小鼠，雌雄各半，體重(18±2) g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，寄養(yǎng)于浙江工業(yè)大學實驗動物中心動物房內(nèi)，小鼠飼料營養(yǎng)成分如表1所示；頭孢曲松鈉購自山東潤澤制藥有限公司；乙酸、丙酸、丁酸和戊酸均購自Sigma-Aldrich；小鼠脂多糖ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。

表1 小鼠飼料營養(yǎng)成分Table 1 Nutrient contents of mice fodder

1.2 動物分組與處理

20 只BALB/c小鼠，按隨機原則進行分組，CK組雌、雄鼠各5 只，模型組(抗生素組)雌、雄鼠各5 只。參照文獻[10]， CK組小鼠自由飲用無菌水，自由攝取食物。模型組小鼠灌胃 125 mg/mL 的頭孢曲松鈉溶液 0.2 mL/次(相當于成人正常劑量的10倍)，每天2次，時間間隔 6 h，連續(xù)灌胃6 d。在0 d和6 d收集小鼠新鮮糞便，- 20 ℃ 保存?zhèn)溆谩２捎酶咄繙y序測定腸道菌群組成，分析抗生素所致小鼠腸道菌群組成的影響。小鼠處死前禁食 6～8 h，眼球取血，脫頸椎處死。血液4 000 r/min，離心10 min，取出上清血清，-20 ℃ 保存。

1.3 DNA提取

每只小鼠收集300 mg的糞便樣品，然后同組樣品混合起來，共有4個混合樣品用于DNA提取。即對照組(CK組)和頭孢曲松鈉組(CRO組)分別在0 d(CK1和CRO1)和6 d(CK2和CRO2)收集的小鼠糞便。利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒從糞便中提取混合宏基因組DNA。

1.4 高通量測序和生物學分析

首先將提取得到的腸道DNA進行PCR擴增和純化回收，然后利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1︰1的等量混合后測序。

1.4.1 原始序列數(shù)據(jù)

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別分析轉化為原始測序序列，其中包含測序序列的序列信息以及其對應的測序質量信息。

1.4.2 數(shù)據(jù)預處理

Miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，將成對的序列拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質量進行質控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.4.3 去除嵌合體及非特異性擴增序列

在PCR反應過程中，會由于延伸不完全產(chǎn)生一些嵌合體。同時也會產(chǎn)生一些非特異性擴增序列。為了保證信息分析質量，必須對其進行剔除。使用Usearch去除預處理后序列中非擴增區(qū)域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調(diào)用uchime進行鑒定嵌合體。隨后，再將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進行blastn比對，低于閾值的比對結果認為是靶區(qū)域外序列，并剔除掉該部分序列。

1.4.4 腸道菌群組成的生物學分析

眾多序列按其序列間的距離進行聚類，然后根據(jù)序列與序列間的相似性當作域值分為操作分類單元(OTU)，一般域值的序列相似性設定為 0.97，則被認為可能屬于屬。對處理后序列進行物種分類，采用的軟件為 RDP classifier，RDP classifier是基于 Bergey’s taxonomy，采用 Naive Bayesian assignment 算法對每條序列在genus 水平上計算其分配到此 rank 中的概率值，一般概率值大于 08，即 RDP 分類閾值，則說明此分類結果可信(測序片段長度<250 時可適當調(diào)低此值到 0.5，如只測 V3，V6，V4 區(qū))。Bergey’s taxonomy分為6層，它們依次為域 (domain)、門 (phylum)、綱 (class)、目 (order) 、科 (family)和屬 (genus)。本實驗主要在門綱目科屬水平上進行優(yōu)勢菌群的分析，探索抗生素對小鼠腸道菌群組成的影響。

1.5 小鼠糞便中短鏈脂肪酸的測定

取100 mg糞便樣品置于10 mL離心管中，加入1.6 mL去離子水溶解，渦旋振蕩2 min鐘，加入 0.4 mL的硫酸(50%硫酸溶液)和 1.5 mL乙醚，250 r/min的搖床中搖晃 45 min，然后 3 000 r/min離心5 min。取上清液于干凈的試管中，加入無水氯化鈣脫水，過0.22 μm濾膜，乙醚定容至1 mL進樣安捷倫氣相色譜檢測。

色譜條件：色譜柱為菲羅門 ZB-FFAP；程序升溫100 ℃保留 2 min，8 ℃升到 240 ℃保持 10 min后運行 230 ℃ 10 min；進樣口為250 ℃；FID為350 ℃；以N2為載氣，流速為1.69 mL/min。

1.6 小鼠血清中脂多糖的測定

采用小鼠(Mouse) 脂多糖ELISA檢測試劑盒，操作如下：1) 從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃；2) 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL；3) 樣本孔先加待測樣品20 μL，再加樣本稀釋液30 μL；空白孔不加；4) 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；5) 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；6) 每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.7 統(tǒng)計學處理

兩組之間的差異用t檢驗進行分析。兩組以上的數(shù)據(jù)采用單因素方差進行分析。

2 結果與分析

2.1 頭孢曲松鈉灌胃對小鼠體重的影響

如圖1所示，與CK組相比，抗生素灌胃后小鼠體重無顯著性變化，體重增加在正常范圍內(nèi)。

圖1 各組小鼠體重變化Fig.1 Weight changes of mice

2.2 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群組成的影響

頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群組成的影響如表2所示。

表2 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群組成的影響 1)Table 2 Effects of ceftriaxone sodium on intestinal flora in mice

注：1) CK為對照組；CRO為頭孢曲松鈉組；1為頭孢曲松鈉處理前；2為頭孢曲松鈉處理后。

2.2.1 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群門水平的影響

由表2可知：實驗前后變化最大的是擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。CK組實驗前后擬桿菌門的數(shù)量增加了12.68%，而頭孢曲松鈉組實驗前后，擬桿菌門的數(shù)量減少了32%；頭孢曲松鈉組實驗前后厚壁菌門豐度增加了25.43%，CK組實驗前后厚壁菌門豐度降低了10.22%。頭孢曲松鈉對擬桿菌門和厚壁菌門的影響超出了CK組變化范圍。

小鼠腸道菌群中主要的優(yōu)勢門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，這三類細菌門的豐度值占總菌群數(shù)的97%以上。擬桿菌門可以消化復雜的碳水化合物，維持腸道正常生理，并且在免疫系統(tǒng)起著重要的作用[11]。與CK組相比，頭孢曲松鈉組灌胃后引起擬桿菌門減少。擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌屬(Bacteroide)都屬于擬桿菌門，且結果與擬桿菌門相似(表2)，表明頭孢曲松鈉灌胃能抑制益生菌(擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌科和擬桿菌屬)生長。厚壁菌門被認為與肥胖、心血管疾病、糖尿病和慢性腸道炎癥的發(fā)生有關，肥胖患者中厚壁菌門比例明顯升高，而擬桿菌門比例明顯下降[12]。與CK組相比，頭孢曲松鈉灌胃后導致小鼠厚壁菌門豐度明顯升高，說明了抗生素能夠造成腸道菌群紊亂。尹金寶研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素暴露兩周后，造成小鼠腸道微生物中擬桿菌門比例下降，厚壁菌門比例提高[13]，與本實驗結果相一致，說明了抗生素對腸道菌群的影響可能存在相似性。

2.2.2 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群綱水平的影響

由表2可知：實驗前后豐度變化最大的是擬桿菌綱(Bacteroidia)和梭菌綱(Clostridia)。頭孢曲松鈉組實驗前后，擬桿菌綱的豐度降低了32.05%，CK組實驗前后擬桿菌綱的豐度增加了12.67%；頭孢曲松鈉組實驗前后梭菌綱豐度增加了21.05%，CK組實驗前后梭菌綱豐度降低了11.89%。頭孢曲松鈉對擬桿菌綱和梭菌綱的影響超出了CK組變化范圍。梭菌綱、梭菌目(Clostridiales)屬于厚壁菌門，Kalia等研究發(fā)現(xiàn)，某些梭菌菌株會產(chǎn)生一些致命的毒素[14]，如艱難梭菌感染是導致抗生素相關性腹瀉的最重要因素之一[15]，與CK組相比，頭孢曲松鈉灌胃后導致小鼠梭菌綱、梭菌目豐度升高，促進了致病菌的產(chǎn)生。

2.2.3 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群目水平的影響

由表2可知：實驗前后影響最大的是梭菌目和擬桿菌目(Bacteroidales)。頭孢曲松鈉組實驗前后，擬桿菌目降低了32.05%，CK組實驗前后擬桿菌目的豐度增加了12.67%；頭孢曲松鈉組實驗前后梭菌目豐度增加了21.04%，CK組實驗前后梭菌目豐度降低了11.88%。頭孢曲松鈉對梭菌目和擬桿菌目的影響超出了CK組變化范圍。

2.2.4 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群科水平的影響

由表2可知：實驗前后擬桿菌科(Bacteroidaceae)變化明顯。頭孢曲松鈉組實驗前后擬桿菌科豐度降低了9.94%，CK組實驗前后擬桿菌科豐度下降了0.36%。

2.2.5 頭孢曲松鈉對小鼠腸道菌群屬水平的影響

在屬水平上各樣本菌群豐度值與細菌總數(shù)的比值見表2，其中實驗前后擬桿菌屬(Bacteroides)和unclassified變化明顯。頭孢曲松鈉組實驗前后擬桿菌屬下降了9.94%，CK組實驗前后下降了0.36%。頭孢曲松鈉組實驗前后unclassified豐度增加了15.55%，CK組實驗前后下降了2.5%。unclassified為未分類菌，其生理作用仍不清楚。

2.3 頭孢曲松鈉對小鼠糞便中短鏈脂肪酸質量分數(shù)的影響

短鏈脂肪酸是腸道微生物通過發(fā)酵過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。短鏈脂肪酸對哺乳動物能量代謝等各方面具有有益作用[16]。短鏈脂肪酸在結腸腔內(nèi)不僅可作為腸黏膜細胞的主要能量來源，還可以減少促炎因子的生成，降低結腸炎癥的發(fā)生。小鼠糞便中短鏈脂肪酸質量分數(shù)如圖2所示。乙酸、丙酸、丁酸和戊酸質量分數(shù)在頭孢曲松鈉處理后比對照組顯著降低，這表明抗生素灌胃后改變了腸道微生物菌群結構，導致有益代謝產(chǎn)物的降低，如短鏈脂肪酸。作為腸道菌群重要的有益代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸已被證實與糖尿病等代謝性疾病密切相關，而抗生素造成的腸道菌群紊亂，也可能與多種代謝性疾病存在潛在的相關性。

圖2 頭孢曲松鈉處理對小鼠糞便中短鏈脂肪酸質量分數(shù)的影響Fig.2 Effects of ceftriaxone treatment on the contents of SCFAs in mice feces

2.4 頭孢曲松鈉對小鼠血清中脂多糖濃度的影響

脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜的一種物質[17]。它可能是導致小鼠代謝性內(nèi)毒素血癥、低度全身炎癥和胰島素抵抗的關鍵物質[18]。腸黏膜屏障是腸道的生物屏障，能阻止有害物質進入血液，兩組小鼠血清中脂多糖濃度如圖3所示。頭孢曲松鈉處理后，小鼠血清中脂多糖濃度顯著高于對照組，說明抗生素處理對腸黏膜屏障造成了損傷。同時，頭孢曲松鈉灌胃引起的血清中脂多糖濃度增加，也會促進炎癥及相關疾病的發(fā)生。

圖3 頭孢曲松鈉處理對小鼠血清中脂多糖濃度的影響Fig.3 Effects of ceftriaxone treatment on the concentration of LPS in mice serum

3 結 論

抗生素使用或暴露可引起腸道菌群紊亂，探索抗生素作用下腸道菌群組成的改變將有利于相關機制研究的深入開展。本研究采用新一代高通量測序技術，通過檢測頭孢曲松鈉灌胃前后小鼠腸道菌群組成的變化，發(fā)現(xiàn)頭孢曲松鈉會改變小鼠腸道菌群組成，造成腸道菌群紊亂，可導致小鼠腸道有害菌(梭菌綱、梭菌目)的豐度增加并抑制益生菌(擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌科和擬桿菌屬)生長；而腸道菌群紊亂可導致短鏈脂肪酸質量分數(shù)下降及脂多糖濃度升高，促進炎癥的發(fā)生。因此，在腸道菌群研究的基礎上，進一步揭示抗生素對機體代謝的影響，探索抗生素相關性腸道菌群修復技術，都將是降低抗生素副作用的重要研究方向。