顏曉慶 ，劉慶亞 ，楊紅寧 ，湯仁仙 ，寇艷波

（徐州醫(yī)科大學1急救與救援醫(yī)學系急診醫(yī)學實驗室；2江蘇省免疫與代謝重點實驗室，江蘇221004）

肝癌（hepatocellular carcinorma，HCC）是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的癌癥之一。53%的肝癌與乙肝病毒（heptitis B virus，HBV）感染有關(guān)[1]。乙肝病毒X蛋白（hepatitis B hirus X protein，HBX）的表達是HBV誘發(fā)肝癌最關(guān)鍵的因素，與肝癌的發(fā)生具有極其密切的關(guān)系[2]。HBX不僅能夠反式激活許多癌基因的表達，還能作為輔激活物參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，甚至可以引起細胞信號通路的異常抑制或激活[3－4]，最終促進HCC的發(fā)生，但HBX誘發(fā)肝癌的具體分子機制并不完全清楚。HBX是一個多功能蛋白，能夠通過與功能執(zhí)行蛋白的直接結(jié)合調(diào)節(jié)其活性，而且可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用間接調(diào)控某些功能執(zhí)行蛋白的轉(zhuǎn)錄[5－6]。例如，HBX通過結(jié)合聚合酶PARP1，抑制DNA損傷修復(fù)復(fù)合物的募集，從而加速DNA損傷，最終引發(fā)肝癌[7]。HBX還能與進化保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的中間產(chǎn)物相互作用，影響NFκB信號通路激活而調(diào)控肝癌的發(fā)生和發(fā)展[8]。除此之外，HBX還能夠間接地影響其他重要信號通路，促進肝癌發(fā)生[9－10]。

早期，研究者們已經(jīng)利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選HBX相互作用蛋白，如HBX與蛋白酶體α亞基、DNA結(jié)合蛋白UVDDB、電壓依賴的離子通道HVDAC3等的相互作用均是通過酵母雙雜交文庫篩選發(fā)現(xiàn)的[11-15]。但是由于早期技術(shù)手段的限制，并不能有效篩選HBX相互作用蛋白。為篩選鑒定新的HBX相互作用蛋白，我們以HBX為誘餌蛋白，將其與GAL4 DBD融合表達。同時，將新一代人肝臟均一化cDNA文庫克隆至AD區(qū)表達載體pGADT7中，通過酵母雙雜交篩選得到多個潛在的HBX相互作用蛋白。進一步驗證及生物學功能探究將為闡明HBX促進肝癌發(fā)生發(fā)展的機制起到重要的推動作用，也將為防治乙肝病毒所引起肝癌的藥物的開發(fā)提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 酵母雙雜交系統(tǒng)包括報告菌株Y2HGold，表達載體pGBKT7和pGADT7，陽性對照組菌株P(guān)53-T由本實驗室保存。均一化的Mate&Plat Library-Human Liver酵母文庫（Takara公司）。高保真DNA聚合酶Primer Star（Takara公司）。預(yù)混2×Taq Master Mix DNA聚合酶（百泰克生物科技有限公司）。限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI，T4 DNA連接酶（Thermo Fisher）。X-Gal、酵母培養(yǎng)基（上海生工生物工程有限公司）。酵母營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基添加物（Yeast synthetic drop-out medium supplements）（Sigma）。酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒（Omega）。酵母菌轉(zhuǎn)化試劑盒（北京酷來搏科技有限公司）。HBX一抗（Millipore）。

1.2 方法

1.2.1 誘餌蛋白HBX表達質(zhì)粒構(gòu)建：由NCBI數(shù)據(jù)庫獲得HBX編碼序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0獲得HBX擴增引物：HBX-F：5’CCGGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGC 3’，HBX-R：5’AAAACTGCAGTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTGCAT 3’。以本實驗室保存的pcDNA3.1-HBX為模板，利用引物HBX-F和HBX-R進行PCR擴增得到HBX編碼序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)除鹽純化后，通過限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI消化并連接至誘餌蛋白表達載體pGBKT7。經(jīng)酶切驗證和測序后，獲得HBX表達質(zhì)粒pGBK-HBX。

1.2.2 酵母菌轉(zhuǎn)化：過夜培養(yǎng)的酵母菌接種至新鮮培養(yǎng)基中，使OD600為0.15～0.3。繼續(xù)培養(yǎng)2～3小時至 OD600為 0.4～0.6，4 ℃，700 g，5 min 離心收集菌體。菌體經(jīng)無菌去離子水洗滌后，利用LiAc法（按照操作手冊進行）制備感受態(tài)，并通過熱激法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母菌體內(nèi)。轉(zhuǎn)化子經(jīng)酵母菌菌液PCR和Western Blot驗證后用于后續(xù)實驗。

1.2.3 酵母菌菌液PCR：取過夜培養(yǎng)的酵母菌菌液100 μL，700 g離心 2 min，棄掉上清后，菌體用 100 μL 50 mM 的NaOH重懸，95℃加熱10 min。加入10 μL Tris-HCl（1 M，pH 8.0）中和后作為模板進行PCR檢測。

1.2.4 自激活和自毒性驗證：以表達HBX的重組酵母菌轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pGADT7，得到自激活和自毒性檢測菌株。分別通過營養(yǎng)缺陷平板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/Aba和 SD/-Leu/-Trp）劃線和梯度稀釋點板的方法檢測HBX的自激活活性和自毒性。

1.2.5 cDNA文庫篩選：以表達HBX的重組酵母為受體菌，Mate&Plat Library-Human Liver酵母文庫為供體，通過Mating的方式（按照操作手冊進行）篩選HBX相互作用蛋白。初步篩選條件為SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade，復(fù)篩條件為 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/Aba，其中 X-α-gal濃度為 40 μg/mL，Aureobasidin（Aba）濃度為 200 ng/mL。將復(fù)篩呈藍綠色，長勢良好的轉(zhuǎn)化子接種至液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～24 h后提取酵母質(zhì)粒。所得酵母質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌擴增后提取質(zhì)粒，得到攜帶目的片段的pGADT7-cDNA。質(zhì)粒測序后獲得編碼與HBX相互作用蛋白的基因序列。

1.2.6 Western blot：菌體破碎上清液經(jīng)蛋白濃度測定后，每孔上樣總蛋白30 μg進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用HBX一抗4℃孵育過夜，洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后分析目的蛋白的存在。

2 結(jié) 果

2.1 誘餌蛋白HBX表達菌株的構(gòu)建 HBX編碼序列經(jīng)EcoRI和PstI酶切后連接進入誘餌蛋白表達載體pGBKT7，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和PstI雙酶切得到438 bp和7.3 kb大小的片段（圖1A），與理論分析一致，再經(jīng)測序分析，序列無誤后命名為pGBK-HBX。將pGBK-HBX通過LiAc法轉(zhuǎn)化進入受體酵母Y2HGold，經(jīng)營養(yǎng)缺陷篩選（不含色氨酸）得到誘餌蛋白HBX表達菌株Y2H-HBX；同時將pGADT7和pGBKT7、pGADT7 和 pGBK-HBX、pGAD-T 和 pGBK-p53分別轉(zhuǎn)化進入Y2HGold得到陰性對照菌株Y2H-AD-NC、自激活和自毒性檢測菌株Y2H-ADHBX和陽性對照菌株Y2H-T-P53。各重組酵母菌菌液PCR和Western blot驗證結(jié)果如圖1B和C所示。通過以上實驗我們成功獲取了誘餌蛋白表達菌株Y2H-HBX，陰性對照菌株Y2H-AD-NC、自激活和自毒性檢測菌株Y2H-AD-HBX和陽性對照菌株Y2H-T-P53。

圖1 Y2H-HBX菌株的構(gòu)建

2.2 HBX自激活活性和自毒性檢測 酵母雙雜交篩選過程中，首先需要保證誘餌蛋白沒有自激活活性也沒有明顯的自毒性，因此本實驗利用平板劃線和梯度稀釋點板實驗進行了HBX自激活活性和自毒性檢測。分別通過SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-β-Gal/Aba培養(yǎng)基進行自激活活性檢測，通過SD/-Leu/-Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進行HBX自毒性檢測。結(jié)果如圖2A和C所示，HBX單獨存在時四個報告基因（his3、ade2、aur1-c、mel1）均不能被激活，說明 HBX沒有自激活活性。HBX的表達也不影響Y2HGold的生長（圖2B和D），說明HBX也沒有自毒性。綜合以上結(jié)果可得出結(jié)論，HBX可以作為誘餌蛋白進行cDNA文庫篩選。

圖2 Y2H-HBX自激活活性和自毒性檢測

2.3 cDNA文庫篩選HBX相互作用蛋白 將Y2HHBX（α型）與 Mate&Plat Library-Human Liver文庫（以a型的Y187為受體菌）Mating后，經(jīng)SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板初步篩選后將長勢良好（報告基因his3啟動），顏色較白（報告基因ade2啟動）的轉(zhuǎn)化子通過劃線轉(zhuǎn)移至SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba平板上進行復(fù)篩，將復(fù)篩藍綠色，長勢良好的轉(zhuǎn)化子經(jīng)酵母質(zhì)粒提取、大腸桿菌擴增和質(zhì)粒測序得到HBX相互作用蛋白基因序列。

本次cDNA文庫篩選過程中，通過平板計數(shù)得到以下數(shù)據(jù)：誘餌蛋白表達菌理論菌落數(shù)為8.12×1010，文庫菌理論菌落數(shù)為1.18×1010，Mating菌落數(shù)為2.97×108。文庫菌落數(shù)是限制因素，因此Mating效率為 Mating菌落數(shù)/文庫菌落數(shù)，即（2.97×108）/（1.18×1010）=2.51%>2%，本次文庫篩選 Mating效率合格。本次篩選總共得到陽性轉(zhuǎn)化子56個，質(zhì)粒測序結(jié)果分析顯示編碼11種蛋白（表1）。將這些質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化至 Y2H-HBX，表明 X11、X17、X31、X34、X47所編碼的5個蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中能夠與HBX相互作用。

3 討 論

我國是乙肝大國，乙肝病毒感染最終導(dǎo)致肝癌發(fā)生的臨床案例更是多不勝數(shù)。深入了解乙肝病毒感染導(dǎo)致肝癌發(fā)生的分子機制，將為尋找治療乙肝病毒相關(guān)肝癌藥物的靶標提供可靠的基礎(chǔ)。HBV感染是誘發(fā)肝癌的最重要因素，上世紀已有統(tǒng)計表明HBV感染的人群肝癌發(fā)病率要高于HBV陰性人群200多倍[16]。HBV感染促進肝癌發(fā)生發(fā)展的假說很多，如HBV感染后病毒復(fù)制導(dǎo)致胞內(nèi)代謝紊亂，HBV基因整合至肝細胞基因組中引起某些基因的錯誤表達等。其中最被研究者們所公認的就是HBV編碼的蛋白通過改變宿主細胞基因表達模式及改變胞內(nèi)信號通路的活化狀態(tài)而促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展。完整的HBV基因組由四個相互重疊的開放閱讀框構(gòu)成，分別是S、P、C和X[17]。其中S主要編碼表面抗原，是乙肝病毒感染檢測的重要指標；P主要編碼乙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶-乙肝DNA多聚酶；C主要編碼核心抗原和E抗原，是構(gòu)成完整病毒顆粒不可缺少的成分；X編碼HBX蛋白，HBX除參與調(diào)控乙肝病毒復(fù)制外，還影響著肝癌的發(fā)生[18]。研究表明HBX不僅能激活原癌基因，還能夠以輔激活物的形式調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，影響基因轉(zhuǎn)錄，甚至可以改變胞內(nèi)信號通路的活化狀態(tài)[19-22]。因此，闡明HBX促進肝癌發(fā)生發(fā)展的機制將是研究乙肝病毒感染所引起的肝癌的重中之重。由于HBX本身沒有DNA結(jié)合活性，所以鑒定與HBX直接相互作用的蛋白，并明確HBX與該蛋白結(jié)合后所介導(dǎo)的生物學過程是闡明HBX促進肝癌發(fā)生發(fā)展機制的關(guān)鍵點。

酵母雙雜交cDNA文庫篩選是一種常用的鑒定蛋白相互作用的方法[11]。做酵母雙雜交cDNA文庫篩選實驗時，分別將目的蛋白與釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DBD區(qū)（DNA binding domain）融合表達，將cDNA文庫編碼的蛋白與GAL4的AD區(qū)（activation domain）融合表達。若目的蛋白能與文庫編碼的蛋白結(jié)合，則可使各自融合的GAL4 DBD區(qū)和AD區(qū)靠近，形成完整有活性的GAL4，啟動報告基因表達[12]。酵母雙雜交cDNA文庫篩選相互作用蛋白具有敏感性高，操作步驟相對簡單，應(yīng)用范圍廣，篩選通量大等特點。本研究通過酵母雙雜交cDNA文庫篩選鑒定了HBX相互作用蛋白。文庫篩選采用Mating的方法，效率為2.5%超過2%，Mating效率合格，表明篩選覆蓋面較完全。自激活活性檢測和自毒性活性檢測結(jié)果顯示HBX本身在酵母中沒有明顯的自激活活性，也沒有自毒性，說明其作為誘餌蛋白是合理可靠的。經(jīng)篩選及初步鑒定，得到5個潛在的HBX相互作用蛋白，進一步的驗證及生物學功能探究將為闡明HBX促進肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制起到積極的推動作用。

本研究中通過酵母雙雜交cDNA文庫篩選，雖然得到了5個潛在的HBX相互作用蛋白（具體蛋白信息見表1），但是由于酵母雙雜交系統(tǒng)有自身諸多的不足，如：強制使文庫編碼的蛋白入核，使自然狀態(tài)下空間分布不可能在一起的兩個蛋白相互作用呈陽性；檢測過于靈敏，酵母雙雜交系統(tǒng)采用高拷貝和強啟動子的表達載體使誘餌蛋白和文庫編碼的蛋白均處于過表達狀態(tài)，易將信號過分放大；此外，蛋白共定位也可激活報告基因，比如誘餌蛋白和待檢測蛋白沒有物理上的直接相互作用，但是如果這兩個蛋白在空間定位上足夠靠近也容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。因此，篩選得到的這些潛在的HBX相互作用蛋白還需要通過進一步的驗證，如通過免疫共沉淀或熒光共振能量轉(zhuǎn)移等實驗來驗證這些蛋白在肝細胞或肝癌細胞內(nèi)是否真正能與HBX相結(jié)合。此外，也可將HBX免疫沉淀后，將共沉淀產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)譜檢測來尋找HBX相互作用蛋白。此法不能有效排除非直接性相互作用，但是，可通過酵母雙雜交來進行驗證，排除非直接性相互作用。

本研究中通過酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合新一代肝臟均一化cDNA文庫并沒有篩選得到已報道的HBX相互作用蛋白，可能原因如下：（1）早期研究中通過酵母雙雜交文庫篩選得到的HBX相互作用蛋白多為肝臟中高表達的蛋白，如蛋白酶體α亞基、UVDDB1和HVDAC3；（2）許多研究者通過免疫沉淀和質(zhì)譜鑒定的手段也得到了多個HBX相互作用蛋白，但是這些蛋白與HBX的相互作用未必是直接相互作用，而酵母雙雜交系統(tǒng)只能鑒定HBX的直接相互作用蛋白，因此本次篩選沒有得到這類已報道的HBX相互作用蛋白。值得注意的是Lwa等[23]曾報道GNB5（guanine nucleotide binding protein β5 subunit）能夠與HBX相互作用。GNB5與本研究中篩選得到的GNB2L1均屬于WD repeat蛋白家族，氨基酸序列上有較大的相似性，GNB2L1極有可能是HBX的直接相互作用蛋白。

前期的臨床研究數(shù)據(jù)顯示病毒性肝炎或中毒性黃疸型肝炎患者血清葡萄糖磷酸變位酶活性明顯升高，并且早期還有研究表明，紅細胞來源的葡萄糖磷酸變位酶 1（Phosphoglucomutase-1，PGM1）還可作為急性淋巴細胞白血病患者骨髓移植預(yù)后的重要指標[24]；乳腺癌易感基因BRCA的異常則與乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)[25－26]，BRCA是基因組完整性的動態(tài)調(diào)節(jié)者，BRCA在DNA損傷修復(fù)和某些基因的表達調(diào)控中發(fā)揮非常重要要的作用，它們功能的異?？梢詫?dǎo)致基因突變的積累，最終會影響包括乳房和卵巢在內(nèi)的多個器官的癌癥的發(fā)生和發(fā)展[27]；鳥嘌呤核甙酸結(jié)合蛋白（guanine nucleotide-binding pro tein，GNB）β亞基過表達則能夠引起細胞周期調(diào)控蛋白和細胞凋亡調(diào)控蛋白的異常表達，促進抗雌激素藥物抵抗的乳腺癌細胞的增殖并能縮短它們的細胞周期[28]。結(jié)合其他學者的研究結(jié)果，我們有理由推測本研究篩選得到的5種蛋白中，至少葡萄糖磷酸變位酶 1（PGM1）、乳腺癌基因（BRCA）復(fù)合物亞基以及鳥嘌呤結(jié)合蛋白（GNB）與乙肝病毒感染或惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。提示HBX可能通過與PGM1、BRCA1或GNB的相互作用改變它們的活性，從而調(diào)控自身在肝細胞中的存在或影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。

HBX相互作用蛋白的篩選及進一步的驗證，將鑒定得到肝細胞或肝癌細胞中與HBX直接相互作用的蛋白，深入分析HBX結(jié)合這些蛋白對它們功能的影響及影響機制，將有利于人們更加明確乙肝病毒在肝細胞中長期存在和促進肝癌發(fā)生的過程，也將為治療乙肝病毒感染及防治乙肝病毒感染引起的肝癌的藥物的開發(fā)研制提供新的靶點。