張 晨，王明宇，葉建偉，李新建，韓雪蕾，王克君，呂 剛，李改英，任廣志，李 明，喬瑞敏

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000)

確山黑豬具有適應(yīng)性強，肉質(zhì)細嫩、色暗紅、富含大理石紋等優(yōu)良特征。確山黑豬分布于確山周邊，分布面積較廣，數(shù)量較多，但因其生長速度慢、瘦肉率低，在1998年前后確山黑豬數(shù)量急劇下降[1]。線粒體DNA是高等動物體內(nèi)的母系遺傳物質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)簡單、保守型強、進化速率快等特點，是研究遺傳進化的理想材料[2-3]。D-loop區(qū)是線粒體DNA上的一段非編碼區(qū)，受進化壓力小[4-5]，遺傳變異程度高且進化速率快，是其他區(qū)段的5倍[5-6]，常被用來開展遺傳進化研究。本研究通過擴增確山黑豬保種場內(nèi)現(xiàn)存全部38頭公豬個體的線粒體D-loop區(qū)段，分析該區(qū)段內(nèi)的遺傳多態(tài)性，評估確山黑豬的遺傳多樣性現(xiàn)狀和品種內(nèi)個體間的親緣關(guān)系，旨在為后續(xù)有效保護和開發(fā)利用確山黑豬提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

本研究中的確山黑豬來自河南省駐馬店確山黑豬保種場，采集場內(nèi)全部38頭公豬個體的新鮮耳組織樣品，置于1 mL 75%乙醇中保存，采用酚-氯仿法提取DNA[7]。利用Nanodrop 2000和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量。

1.2 PCR擴增和測序

PCR擴增的上游引物為：5'-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3'，下游引物為： 5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'[8]，引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。采用25 μL的反應(yīng)體系：包括40 ng DNA，12.5 μL 2×ES Taq MasterMix(康為世紀 CW2214M)，10 pmol正反向引物，8.5 μL水。擴增條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；51.3 ℃，30 s；72 ℃，50 s，25個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，檢測合格后送往南京金斯瑞生物有限公司進行雙向測序。

1.3 序列比對和進化分析

利用DNASTAR 7.1.0軟件中的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進行比較。將確山黑豬D-loop區(qū)序列與NCBI上公布的長白豬(NC_000845.1)的D-loop區(qū)段參考序列進行比對，比較二者之間的核苷酸序列差異，獲得確山黑豬D-loop區(qū)的核苷酸變異情況。從NCBI上下載杜洛克豬(MF183225.1)、大白豬(KF752550.1)、萊蕪黑豬 ( KJ720205.1)、二花臉豬(AF486861.1)的D-loop區(qū)序列。河南地方豬南陽黑豬、淮南黑豬、豫西黑豬的線粒體D-loop區(qū)序列來自本實驗室的測序結(jié)果。利用DnaSP 5.0構(gòu)建單倍型，用MEGA 7.0軟件的最大似然法，對38頭確山黑豬公豬個體的線粒體D-loop區(qū)及上述序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測及測序

確山黑豬線粒體D-loop區(qū)的PCR擴增結(jié)果見圖1，產(chǎn)物大小為1 175 bp。經(jīng)過Sanger雙向測序后，選取D-loop區(qū)內(nèi)拷貝數(shù)變異(repeat_region)之前測序質(zhì)量較好的630 bp片段，使用SeqMan對38頭確山公豬的76條序列和參考序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在確山黑豬中共檢測到17個核苷酸變異(見表1)。

圖1 確山黑豬線粒體D-loop區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖1-9、11-17．確山黑豬；10.陰性對照；M.2000 bp DNA markerFig.1 Electrophoresis of PCR products of mitochondriaD-loop region of Queshan Black pigs1-9，11-17．Queshan Black pig; 10. negative control;M.2000 bp DNA marker

表1 確山黑豬D-loop區(qū)內(nèi)的單核苷酸突變及單倍型分類Table 1 Single nucleotide polymorphisms and haplotypes of D-loop region of Queshan Black pigs

注：109-575表示17個核苷酸突變的位置；·表示與Hap 1相同堿基；-表示堿基缺失。

Note:109-575 represents the positions of 17 nucleotide mutations; · represents the same base as Hap 1; - represents base deletion.

2.2 單倍型及進化樹分析

由表1知，38頭確山黑豬分屬于9種單倍型，依據(jù)單倍型內(nèi)個體數(shù)的多少依次命名為Hap 1～ Hap 9。Hap1為優(yōu)勢單倍型，出現(xiàn)在21個個體中，Hap 2 ～ Hap 9依次存在于5、5、2、1、1、1、1、1個個體中。

由圖2可見，確山黑豬相對聚為一簇，品種內(nèi)的9種單倍型聚為7支，其中，Hap1和Hap4與其他個體關(guān)系稍遠。增加分析河南省其它地方豬種，結(jié)果并沒有增加D-loop區(qū)的單倍型數(shù)目。其中，南陽黑豬的單倍型同為Hap1，豫西黑豬、淮南黑豬的單倍型同為Hap4。確山黑豬與西方商業(yè)豬種總體的親緣關(guān)系較遠，與中國地方豬關(guān)系更近。確山黑豬與大白豬的關(guān)系稍近于杜洛克豬和長白豬；相比于萊蕪黑豬，確山黑豬與與二花臉豬的親緣關(guān)系更近。

圖2 確山黑豬和西方商業(yè)豬種以及中國地方豬種D-loop區(qū)單倍型NJ進化樹Fig.2 The neighbor-joining tree of haplotypes of D-Loop region in Queshan Black pigs and westerncommercial pigs and Chinese indigenous pigs

3 討 論

河南省確山縣大王山確山黑豬保種場內(nèi)采用隨機交配，場內(nèi)放養(yǎng)、圈養(yǎng)相結(jié)合的飼養(yǎng)管理方式，為了更好地保護和開發(fā)利用確山黑豬，明確品種內(nèi)不同個體的血緣關(guān)系是首要任務(wù)。本研究首次對確山黑豬開展遺傳評估工作，通過測定現(xiàn)存全部38頭公豬個體的線粒體D-loop區(qū)序列，分析其遺傳多態(tài)性和個體間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，與參考序列相比，確山黑豬存在17個核苷酸變異，個體間存在一定差異，17個突變分屬于9種單倍型，說明確山黑豬的遺傳多態(tài)性較為豐富，也在一定程度上提示確山黑豬的保種壓力不大，可以進一步開發(fā)利用。

比較確山黑豬、與杜洛克豬、長白豬、大白豬及鄰近地區(qū)豬種的D-loop區(qū)序列，為確定和利用確山黑豬的母系血緣提供參考。利用單倍型構(gòu)建的進化樹顯示，確山黑豬母系血緣與西方品種距離較遠，確山黑豬與大多數(shù)中國地方豬一樣，與西方豬種相比單獨聚為1類；品種內(nèi)9種單倍型聚為7個分支，反映了確山黑豬品種內(nèi)遺傳多樣性較為豐富，為當前的育種工作和生產(chǎn)服務(wù)提供了有效的分子水平的理論參考，為下一步的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。鑒于D-loop區(qū)序列較短，有必要進一步對確山黑豬的全線粒體基因組和核基因組開展遺傳評估。