枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)以及產(chǎn)毒效果的影響

隋 明，朱克永,張崇軍,王靜霞，唐賢華,周榮清

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川都江堰 611830；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都 610000；)

黃曲霉毒素主要由曲霉屬真菌中黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1等10多種，其中以黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)[1-2]。黃曲霉毒素廣泛存在環(huán)境中的土壤、植物果實(shí)中，主要以發(fā)霉及污染的玉米和花生中含量較高，對(duì)人和動(dòng)物具有致畸、致癌、致突變作用[3]。人攝入過(guò)量的黃曲霉毒素時(shí),會(huì)引起人的急性中毒及致癌，被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類致癌物，食品中黃曲霉毒素能給人和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的威脅[4-5]。乳酸菌是主要存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種有益菌，可以有效調(diào)整胃腸道內(nèi)菌群動(dòng)態(tài)平衡，抑制腐敗菌生長(zhǎng)及腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生，另外，對(duì)黃曲霉毒素B1有一定的吸附與抑制作用[6]?？莶菅堪麠U菌是一種常用的發(fā)酵食品菌種，該菌自身可以合成多種酶類物質(zhì)，這些酶類物質(zhì)不僅可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以抑制腸道內(nèi)條件致病菌，被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中[7]。關(guān)于乳酸菌抑制黃曲霉菌研究比較多，但是枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物是否可抑制黃曲霉菌未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)選用了枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研發(fā)黃曲霉菌抑制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產(chǎn)毒黃曲霉菌CGMCC3.4408標(biāo)準(zhǔn)菌株、枯草芽胞桿菌菌株、乳酸菌菌株由四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、產(chǎn)毒培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧星生物技術(shù)公司；AFB1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀由德國(guó)eppendour公司生產(chǎn)；PBST、培養(yǎng)皿、EP管、移液槍、分析天平及分析純等常規(guī)試劑及儀器由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 黃曲霉菌培養(yǎng)與孢子計(jì)數(shù) 將黃曲霉菌CGMCC3.4408標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d～8 d后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。取擴(kuò)大培養(yǎng)的黃曲霉菌培養(yǎng)基，加入一定量的無(wú)菌的PBST，將用黃曲霉菌洗脫后，收集到EP管中，用無(wú)菌的PBST 8 000 r/min 5 min洗滌3次后，再用無(wú)菌紗布過(guò)濾3次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進(jìn)行計(jì)數(shù)。用無(wú)菌的PBST調(diào)整黃曲霉菌孢子濃度為1×108cfu/mL備用。

1.2.2 枯草芽胞桿菌和乳酸菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 將枯草芽胞桿菌菌株復(fù)蘇后接種LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后，接種在MRS培養(yǎng)基中增殖3代后，進(jìn)行計(jì)數(shù)，用MRS培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；將乳酸菌菌種接種MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，用MRS培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108cfu/mL；將枯草芽胞桿菌、乳酸菌按照1∶1比例制成混合培養(yǎng)物。

1.2.3 黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 取枯草芽胞桿菌、乳酸菌及枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物各1 mL，分別涂布PDA培養(yǎng)基上，待中藥水提物藥液液體完全被吸收后，在PDA培養(yǎng)基中心接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液(1×108cfu/mL)，28℃進(jìn)行培養(yǎng)，分別在黃曲霉菌培養(yǎng)后48、72、96 h測(cè)量菌落大小。每種益生菌做10個(gè)重復(fù)，并10個(gè)重復(fù)的結(jié)果平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算不同益生菌對(duì)霉菌生長(zhǎng)的抑制率。對(duì)照組在PDA培養(yǎng)基上直接接種20 μL黃曲霉菌孢子懸液(1×108cfu/mL)。黃曲霉菌生長(zhǎng)抑制率(%)=(空白對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑)/空白對(duì)照組菌落直徑×100。

1.2.4 黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 取5 mL的察氏培養(yǎng)基分別加入等量的枯草芽胞桿菌、乳酸菌、枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物，分別接種500 μL的黃曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)，每種益生菌做10個(gè)重復(fù)，28℃振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后的6、18、24 h取出每種益生菌培養(yǎng)液各0.1 mL均勻涂布PDA平板，28℃培4 h～8 d后，對(duì)照組取5 mL的察氏培養(yǎng)基接種500 μL的黃曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)，對(duì)黃曲霉菌孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。黃曲霉菌胞子孢生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式為：抑制率(%)=(空白對(duì)照組孢子數(shù)-試驗(yàn)組孢子數(shù))/空白對(duì)照組孢子數(shù)×100。

1.2.5 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測(cè)定 無(wú)菌條件下，在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中均勻涂布2 mL甘油水溶液，待液體完全被吸收，分別接種黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率試驗(yàn)中，用枯草芽胞桿菌、乳酸菌、枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物培養(yǎng)6、18、24 h后培養(yǎng)液0.1 mL分別接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基，35℃恒溫培養(yǎng)15 d～20 d；空白對(duì)照組，將無(wú)菌的生理鹽水和黃曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)按照1∶1比例配合均勻后，取0.1 mL用同樣方法接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，35℃恒溫培養(yǎng)15 d～20 d。試驗(yàn)結(jié)束后提取黃曲霉菌，并按照AFB1檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定其產(chǎn)毒量。霉菌產(chǎn)毒量抑制率(%)=(空白對(duì)照組產(chǎn)毒量-試驗(yàn)組產(chǎn)毒量)/空白對(duì)照組產(chǎn)毒量×100。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan′s 法進(jìn)行均值比較，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果

由表1可知，3種不同類型的益生菌處理組對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)有不同程度的抑制效果，在培養(yǎng)48 h時(shí)，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)率均高于枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌處理組，但是差異不顯著(P>0.05)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3種不同類型的益生菌處理組對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制效果也有所增加，在培養(yǎng)72 h和96 h時(shí)，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對(duì)霉菌菌落生長(zhǎng)率分別與枯草芽胞桿菌和乳酸菌處理組相比較，差異顯著(P<0.05)，枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌2個(gè)組處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同類型的益生菌對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果(%)

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

2.2 黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果

由表2可知，3種不同類型的益生菌處理組對(duì)黃曲霉菌菌孢子生長(zhǎng)有不同程度的抑制效果，在培養(yǎng)6 h、18 h、24 h時(shí)，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對(duì)黃曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞桿菌處理組和乳酸菌處理組，差異顯著(P<0.05)，枯草芽胞桿菌處理組與乳酸菌處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒量的測(cè)定結(jié)果

由表3可知，3種不同類型的益生菌處理組對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量有不同程度的抑制效果，在培養(yǎng)6 h時(shí)，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對(duì)黃曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞桿菌處理組和乳酸菌處理組，但是差異不顯著(P>0.05)；在培養(yǎng)18 h、24 h時(shí)，枯草芽胞桿菌和乳酸菌混合培養(yǎng)物處理組對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒與枯草芽胞桿菌處理組、乳酸菌處理組相比較，差異顯著(P<0.05)，枯草芽胞桿菌處理組與乳酸菌處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同類型的益生菌對(duì)黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果(%)

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

表3 不同類型的益生菌對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒量抑制率測(cè)定結(jié)果(%)

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母為差異不顯著(P>0.05)，不同字母為差異顯著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

3 討論

人的黃曲霉毒素中毒主要來(lái)源是食品，由于黃曲霉菌廣泛存在環(huán)境中或者發(fā)霉變質(zhì)的食品原料中，食品在加工過(guò)程中易受到黃曲霉毒素的污染，當(dāng)人食用了被黃曲霉菌污染的食品，黃曲霉毒素主要積蓄在肝臟，導(dǎo)致肝臟解毒功能下降，還可以在人體內(nèi)產(chǎn)生毒素，毒素隨著血液循造成人全身的中毒狀態(tài)，嚴(yán)重著可導(dǎo)致死亡[8]。有效控制黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒量，才能減少食品中黃曲霉毒素污染。黃曲霉毒素清除方法主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物去毒法，其中生物去毒法被方法被廣泛應(yīng)用[9-10]。許多研究表明乳酸桿菌等益生菌對(duì)黃曲霉素毒素具有一定吸附作用。姚婉等[11]研究表明富硒乳酸菌抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)以及產(chǎn)毒具有很好抑制效果。EraslanG等[12]研究表明在黃曲霉菌培養(yǎng)過(guò)程中添加乳酸菌可以抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)。

國(guó)內(nèi)關(guān)于乳酸菌抑制黃曲霉菌研究比較多，但是枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌抑制黃曲霉菌未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)將枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌按照1∶1比例制成混合培養(yǎng)物，進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)混合培養(yǎng)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒影響。結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌混合培養(yǎng)物對(duì)黃曲霉菌菌落生長(zhǎng)抑制率、黃曲霉菌孢子生長(zhǎng)抑制率及黃曲霉產(chǎn)毒量均高于枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌，差異顯著(P<0.05)，因而證實(shí)了枯草芽胞桿菌和乳酸桿菌混合物有效抑黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒量。從而證實(shí)許多枯草芽胞桿菌可以提高乳酸桿菌對(duì)黃曲霉菌落生長(zhǎng)、黃曲霉孢子生長(zhǎng)和黃曲霉菌產(chǎn)毒量，兩者具有協(xié)同作用?？莶菅堪梢苑置诳莶菥丶岸虠U菌肽等多種活性化學(xué)物質(zhì)，這些活性化學(xué)物質(zhì)可以抑制外界的病菌、毒素等異物?？赡苡捎诳莶菅堪置诘幕钚曰瘜W(xué)物質(zhì)可以抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)，吸附或者分解黃曲霉菌所產(chǎn)生的毒素，從而提高黃曲霉菌菌落和生長(zhǎng)抑制率及產(chǎn)毒量抑制率?？莶菅堪麠U菌和乳酸桿菌等益生菌對(duì)黃曲霉毒素菌作用機(jī)理復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。