侯明果

重慶市永川國(guó)有林場(chǎng) 重慶 402160

1 竹葉黃酮提取工藝的研究

1.1 試驗(yàn)材料

毛竹一年生長(zhǎng)成葉。

1.2 主要藥品與試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水。試驗(yàn)中所用試劑均為市售分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、分析天平、真空抽濾機(jī)、恒溫水浴鍋、恒溫干燥箱、萬(wàn)能粉碎機(jī)、酒精計(jì)、移液器、移液管、容量瓶、量筒、三角瓶、燒杯、玻璃棒、膠頭滴管、洗耳球、漏斗、定性濾紙、封口膜、橡皮筋、剪刀、藥勺。

2 方法

2.1 準(zhǔn)備工作

準(zhǔn)備好試驗(yàn)所用的藥品與試劑、儀器與設(shè)備；采取毛竹葉，并在55℃左右的溫度下將其烘干，粉碎備用；用亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉試劑分別配制5%的亞硝酸鈉溶液、10%的硝酸鋁溶液、4%的氫氧化鈉溶液，用乙醇分別配制20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，置于50ml燒杯中，加適量70%乙醇溶液，水浴微熱使溶解，放冷，將溶液轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，并用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，得濃度為0.4mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分別置于25ml容量瓶中，用70%乙醇溶液補(bǔ)充至6ml，加入1ml濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置6min，加入1ml濃度為10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入10ml濃度為4%的NaOH溶液，搖勻，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15min，以70%乙醇溶液為空白參比，在510nm的波長(zhǎng)下用比色法測(cè)定吸光度。

以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=12.192x+0.0155，r=0.9997。

2.3 竹葉黃酮的提取與測(cè)定

2.3.1 竹葉黃酮提取液的制備

稱取約2g毛竹葉粉末，并準(zhǔn)確記載稱取的質(zhì)量，置于三角瓶中，加入所選擇濃度和體積的乙醇溶液，搖勻，并在所選擇的溫度下和時(shí)間內(nèi)加熱，抽濾，將濾液保留并將濾渣置于三角瓶中，加入濃度和體積與之前相同的乙醇溶液，并在與之前的溫度和時(shí)間都相同的條件下加熱，再抽濾，并將此次所得濾液與上次的濾液合并，將合并后的濾液定容至100ml，搖勻，得竹葉黃酮提取液。此方法與過(guò)程應(yīng)當(dāng)重復(fù)三次。

2.3.2 竹葉黃酮的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取5ml竹葉黃酮提取液于25ml容量瓶中，加入1ml70%的乙醇溶液，搖勻，加入1ml 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6min，加入10% AL(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入10ml 4%NaOH溶液，搖勻，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15min，過(guò)濾，以70%乙醇溶液為空白參比，在510nm的波長(zhǎng)下用比色法測(cè)定吸光度[2]。此方法與過(guò)程應(yīng)當(dāng)重復(fù)三次。根據(jù)吸光度和回歸方程計(jì)算黃酮含量并依據(jù)以下公式求得總黃酮含量：總黃酮含量（mg/g）=黃酮含量（mg/ml）×稀釋倍數(shù)（5倍）×濾液定容體積（100ml）/竹葉干粉質(zhì)量（g）。

2.4 水浴提取單因素試驗(yàn)

從提取溫度60℃、固液比1：15、提取時(shí)間1.5h、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%中依次選擇3個(gè)因素固定條件，剩余一個(gè)因素條件依次分成 5 個(gè)梯度（乙醇體積分?jǐn)?shù) 20%、40%、60%、80%、90%，固液比 1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，提取時(shí)間 0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，提取溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），按2.3的方法與過(guò)程對(duì)竹葉黃酮進(jìn)行提取與測(cè)定。

2.5 水浴提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在四個(gè)因素中各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)方法與過(guò)程按2.3進(jìn)行。采用 DPS 軟件進(jìn)行方差分析、Duncan 新復(fù)極差法檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 水浴提取單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于60%時(shí)，提取的總黃酮平均含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取的總黃酮平均含量達(dá)到最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，提取的總黃酮平均含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而降低。因此，提取黃酮時(shí)，乙醇的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)當(dāng)控制在60%左右[3]。

3.1.2 固液比對(duì)黃酮提取的影響

當(dāng)固液比大于或等于1：25時(shí)，提取的總黃酮平均含量隨著固液比的減小而升高，固液比小于1：25時(shí)，隨著固液比的減小，提取的總黃酮平均含量幾乎沒(méi)有變化。因此，在提取黃酮時(shí)，最好將固液比控制在1：25左右。

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響

提取的總黃酮平均含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)1.5h時(shí)，提取的總黃酮平均含量基本沒(méi)有變化。因此，在提取黃酮時(shí)，最好將提取時(shí)間控制在1.5h 左右。

3.1.4 提取溫度對(duì)黃酮提取的影響

當(dāng)提取溫度小于60℃時(shí)，提取的總黃酮平均含量隨著提取溫度的升高而升高；當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，提取的總黃酮平均含量達(dá)到最大；當(dāng)提取溫度大于60℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，提取的總黃酮平均含量逐漸降低。因此，在提取黃酮時(shí)，最好將提取溫度控制在60℃左右。

3.2 水浴提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

該正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析的結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)黃酮提取均有極顯著的影響，影響程度依次為：固液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。通過(guò)單因素和處理組合間的多重比較結(jié)果綜合分析，可以確定提取竹葉黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，固液比為1：25，提取時(shí)間為1.0h，提取溫度為70℃。

4 不同竹種黃酮含量的研究

4.1 材料

4.1.1 試驗(yàn)材料

毛竹、慈竹、孝順竹、斑竹的一年生長(zhǎng)成葉。

4.1.2 主要藥品與試劑

同第一章1.2。

4.1.3 主要儀器與設(shè)備

同第一章1.3。

4.2 方法

4.2.1 準(zhǔn)備工作

采取慈竹、孝順竹、斑竹葉，其它同第一章2.1。

4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

標(biāo)準(zhǔn)回歸方程同第一章2.2。

4.3 竹葉黃酮的提取與測(cè)定

4.3.1 竹葉黃酮提取液的制備

取竹葉（慈竹、孝順竹、斑竹）粉末為原料，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選所得工藝條件和第一章2.3.1的方法進(jìn)行提取。

4.3.2 竹葉黃酮的測(cè)定

同第一章2.3.2。

5 結(jié)果與分析

在第一章所得的竹葉黃酮提取最佳工藝條件下，測(cè)得不同竹種的竹葉總黃酮平均含量(mg/g)依次為：斑竹19.245＞毛竹18.264＞孝順竹6.562＞慈竹4.816，慈竹、孝順竹的竹葉黃酮含量較低，可利用性較低；而斑竹、毛竹的竹葉黃酮含量較高，可利用性較強(qiáng)。

6 總結(jié)與討論

（1）竹葉黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)ψ=70%，固液比為1：25，提取時(shí)間t=1.0h，提取溫度T=70℃。

（2）對(duì)竹葉黃酮提取影響最大的是固液比，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，再次是提取溫度，影響最小的是提取時(shí)間。因此，在進(jìn)行竹葉黃酮提取時(shí)，必須注意各工藝參數(shù)的調(diào)控，特別是對(duì)竹葉黃酮提取率影響最大的固液比。

（3）在各竹種中，斑竹、毛竹的竹葉黃酮含量較高，可利用性較好。建議充分利用其這一特點(diǎn)，加強(qiáng)對(duì)斑竹和毛竹竹葉黃酮的利用，提高斑竹和毛竹資源的利用率。

（4）本次研究所得出的結(jié)論具有很好的實(shí)用性和可操作性，有利于規(guī)?；a(chǎn)，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但由于所研究的竹種相對(duì)較少，也存在一定的不足，以期進(jìn)一步完善。