不同濃度食醋對常見泡菜亞硝酸鹽含量的影響探究

凌榮秀 樊郁蘭 劉 娜 解凱彬

（南京師范大學教師教育學院 江蘇南京 210024）

“制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量”是人教版高中生物學教材中的一個經(jīng)典選修實驗。師生在該實驗中，通常只測定亞硝酸鹽含量，但鮮少關(guān)注影響含量變化的因素，且對其中原理解釋不清晰，缺乏探究意識。泡菜中含有一定量的亞硝酸鹽，當其含量超過一定的濃度范圍后，易與胺產(chǎn)生致癌物，對人體有嚴重的危害。研究表明，泡菜在發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽含量呈先上升到達峰值再下降的趨勢［1］，且泡菜的發(fā)酵方式、溫度、食鹽濃度、泡菜液的pH等都會對其含量的變化產(chǎn)生影響［2］。食醋是常見的酸性食品調(diào)味劑，加酸處理后的泡菜亞硝峰生成水平顯著降低［3］。

本文通過研究在白蘿卜、白菜、豇豆3種泡菜中添加不同濃度的食醋后亞硝酸鹽含量的變化，為中學“制作泡菜并檢測亞硝酸鹽含量”的實驗提供一種探究思路，提升學生理性思維和科學探究能力。此外，在響應課程標準探究理念的同時，嘗試解釋食醋對不同種泡菜中亞硝酸鹽含量影響的原因，并為學生的實際生活提出合理建議。

1 實驗原理

在酸化條件下，對氨基苯磺酸與亞硝酸鹽發(fā)生重氮反應，生成的重氮鹽與N-1-萘基乙二胺耦合，生成玫瑰紅色染料（ADDBS），產(chǎn)物ADDBS的紫外吸收光譜在550 nm附近具有最大吸收值［4］。本實驗通過配制不同濃度梯度的亞硝酸鹽溶液，顯色后在550 nm波長下進行光電比色，測得OD值，運用Excel軟件繪制出標準曲線，得出線性回歸方程，測出實驗樣品的OD值后，利用關(guān)系式推算則可得出實驗樣品中亞硝酸鹽含量。

2 材料與方法

2.1 材料 白蘿卜、豇豆、白菜、姜、干紅辣椒、食鹽、食醋（白醋）。

2.2 試劑 60%乙酸、20 g/L NaOH溶液、NH4Cl緩沖液（pH：9.6～9.7）、0.42 mol/L ZnSO4溶液、顯色液、NaNO2濃度梯度標準液。

1）顯色液的配制。

①對氨基苯磺酸溶液：取0.5 g對氨基苯磺酸，溶于35 mL蒸餾水和15 mL冰乙酸中混勻，置于棕色瓶中保存；

②N-1-萘基乙二胺溶液：取0.5 g N-1-萘基乙二胺，加入500 mL 60%乙酸溶液，混勻后置于棕色瓶放入冰箱中保存，1周內(nèi)保持穩(wěn)定；

初檢共獲得相關(guān)文獻333篇，經(jīng)逐層篩選，最終納入21個研究。文獻篩選流程及結(jié)果見圖1。納入研究的基本特征見表1。

③顯色液：將上述配制的2種溶液等體積混勻，遮光保存。

2）NaNO2濃度梯度標準液。

①5 μg/mL亞硝酸鈉溶液：稱取0.1 g NaNO2加蒸餾水定容至500 mL，從中吸取5 mL再加蒸餾水稀釋至200 mL，得到5 μg/mL NaNO2溶液；

②不同濃度梯度的NaNO2溶液的配制：用移液管吸取 0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 的 5 μg/mL NaNO2溶液分別置于25 mL 容量瓶中，編號 1～7 號（5 μg/mL×X=Y×25 mL，X指提取初始濃度的體積，Y指欲配制的特定濃度）。分別加入4.5 mL NH4Cl緩沖液、2.5 mL 60%乙酸和5mL顯色液，混勻，加蒸餾水定容至25 mL，在暗處靜置25 min。

2.3 實驗方法

2.3.1 繪制標準曲線 將濃度為 0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL 的 NaNO2溶液， 分別倒入比色杯，放入分光光度計樣品室中，設置波長為550 nm，通過0 μg/mL的樣品進行校準調(diào)零，拉動滑桿，逐一測出樣品的OD值。

根據(jù)NaNO2的濃度與體積計算出NaNO2含量，得出NaNO2含量與相應OD值數(shù)據(jù)表，見表1。運用Excel軟件繪制出標準曲線，見圖1。

表1 不同NaNO2含量對應的OD值

圖1 OD值-亞硝酸鹽含量標準曲線

2.3.2 泡菜樣品中亞硝酸鹽含量測定

2）樣品測定。泡菜中亞硝酸鹽含量測定：①稱取5 g泡菜，研磨成勻漿，加入相應泡菜液6 mL，混合均勻后進行離心，取上清液于小燒杯中，滴加NaOH溶液，調(diào) pH至 8.0，再加入 5 mL ZnSO4，會產(chǎn)生白色沉淀，若不產(chǎn)生則再滴加NaOH溶液，至產(chǎn)生白色沉淀為止。②將上述處理液放入60℃水浴鍋中水浴10 min，取出靜置，冷卻至室溫后過濾到100 mL容量瓶中定容并搖勻。③取10 mL樣品液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶，依次加入2.5 mL 60%的乙酸，4.5 mL NH4Cl緩沖液，5 mL現(xiàn)配顯色液，定容并搖勻，放入暗箱中靜置25 min。④測出樣品液OD值（注意設置空白組進行校準調(diào)零）。

3 結(jié)果與分析

3.1 實驗結(jié)果

1）添加不同濃度食醋的泡白菜中亞硝酸鹽含量變化。圖2為泡白菜中亞硝酸鹽含量的變化。由圖可知：亞硝酸鹽含量第3天到達峰值；相較于對照組而言，食醋對泡白菜中亞硝酸鹽產(chǎn)生有抑制效果，添加食醋后泡白菜中亞硝峰均顯著降低；食醋濃度0.6%情況下，亞硝酸鹽含量普遍最低。

圖2 添加不同濃度食醋的泡白菜中亞硝酸鹽含量變化

2）添加不同濃度食醋的泡豇豆中亞硝酸鹽含量變化。圖3為泡豇豆中亞硝酸鹽含量的變化。由圖可知：亞硝酸鹽含量第3天到達峰值，峰值均小于2 mg/kg；泡豇豆中食醋組亞硝酸鹽含量普遍很低，添加食醋對其亞硝酸鹽的產(chǎn)生有抑制效果，其中1.2%食醋組抑制效果最明顯。

圖3 添加不同濃度食醋的泡豇豆中亞硝酸鹽含量變化

3）添加不同濃度食醋的泡蘿卜中亞硝酸鹽含量變化。圖4為泡蘿卜中亞硝酸鹽含量的變化。由圖可知：亞硝酸鹽含量第3天到達峰值，均低于對照組，其中0.9%食醋組峰值最低。

圖4 添加不同濃度食醋的泡蘿卜中亞硝酸鹽含量變化

總體對3種泡菜而言：亞硝酸鹽含量（泡白菜＞泡蘿卜＞泡豇豆）；亞硝酸鹽含量呈先上升后下降的趨勢；食醋對3種泡菜亞硝酸鹽產(chǎn)生均有抑制效果，但存在一定差異。

3.2 討論

1）3 種泡菜中亞硝酸鹽含量總體變化趨勢及原因。泡菜中亞硝酸鹽含量呈先上升后下降趨勢，與前人研究一致。蔬菜本身含有一定量的硝酸鹽和少量亞硝酸鹽，并且在種植過程中會殘留一些細菌。發(fā)酵初期，乳酸菌含量少，且大多數(shù)乳酸菌本身不帶有硝酸鹽還原酶和氨基酸脫羧酶，其代謝產(chǎn)物不會轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。因此產(chǎn)生亞硝酸鹽的主要是蔬菜中所帶的雜菌，例如大腸桿菌、假單孢子菌等硝酸還原菌［5］。發(fā)酵前期的有氧環(huán)境有利于雜菌生長，大量的硝酸鹽被雜菌還原成亞硝酸鹽，而蔬菜中的酚類物質(zhì)及維生素C能將生成的亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。但整體來說，單位時間內(nèi)生成的亞硝酸鹽大于被氧化的亞硝酸鹽，因此亞硝酸鹽的含量處于上升趨勢。

一段時間后，隨著微生物代謝活動的持續(xù)，泡菜罐中的氧氣消耗殆盡，泡菜中的硝酸鹽含量由于被還原而減少，而乳酸菌等厭氧菌活動強烈，產(chǎn)生大量乳酸，這些條件都不利于硝酸鹽還原菌的生長，因此亞硝酸鹽的產(chǎn)生受到抑制。

2）食醋影響3種泡菜亞硝酸鹽含量的原因。泡菜初期的某些腸桿菌等有害菌能將蔬菜代謝過程中積累的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。添加食醋使泡菜發(fā)酵液pH下降，酸性環(huán)境不利于有害菌的生長和代謝，卻有利于乳酸菌的發(fā)酵，從而使得亞硝酸鹽進行酸降解［6］。柴政等研究表明0.6%食醋對泡白菜亞硝酸鹽產(chǎn)生有較好抑制效果［7］，與本實驗結(jié)論一致。但其亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)在第5天，而本實驗在第3天，推測原因為本實驗進行時溫度較高（20～30℃），微生物（硝酸鹽還原菌）活動較強，泡菜中能迅速產(chǎn)生大量亞硝酸鹽達到峰值，期間氧氣消耗較快，之后乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢菌種，促使亞硝酸鹽含量下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制3種泡菜亞硝酸鹽的最佳食醋濃度不同，推測可能由于3種蔬菜為不同的植物器官，且表面雜菌種類與數(shù)量存在差異，但根本原因有待進一步研究。

3）其他因素影響3種泡菜亞硝酸鹽含量的原因。除食醋外，還有其他諸如食鹽、溫度、泡菜佐料（姜、辣椒）等也會影響泡菜中亞硝酸鹽含量。泡菜發(fā)酵初期，由于乳酸生成量較少，食鹽的抑菌作用成為主要抑菌因素。較高濃度食鹽有效抑制了硝酸鹽還原菌的活動［8］，使硝酸鹽還原過程減慢，所以亞硝酸鹽增長趨勢緩慢，同時溫度較低，會使得微生物活動較弱，從而導致亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時間延后及峰值較小。相反，如果食鹽濃度較低且溫度較高，則對菌的抑制較弱，使得亞硝峰增大。到發(fā)酵中后期時，乳酸菌活動旺盛，大量生成的乳酸會使腌制液的 pH值迅速下降，從而抑制有害細菌生長，減弱硝酸鹽還原菌的還原能力。

由于姜中含有姜油酮、6-姜油酮酚和6-姜烯酚等物質(zhì)，在一定程度上能夠阻斷蔬菜中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此在泡菜中加入適量的姜，對硝酸還原菌具有一定的抑制作用。

4 建議與啟示

4.1 實驗教學

1）明晰實驗原理。日常教學中，本實驗往往停留于教師指導學生進行重復的實驗操作，而忽視深層實驗原理，不利于學生探究性思維的發(fā)展和深度學習。因此，教師應有關(guān)注實驗理論基礎(chǔ)的意識，并培養(yǎng)學生結(jié)合理論分析實驗現(xiàn)象的能力，從而提高學生理性思維。

2）精設實驗方案。教師應善于尋找豐富課程資源，大膽創(chuàng)新拓展實驗；不應選擇泡制后泡菜液發(fā)生明顯變色的蔬菜原料（例如紅皮蘿卜）；不宜選擇低溫和高鹽條件，也不應加入過多姜和辣椒，否則會導致亞硝酸鹽含量過低，從而削弱自變量對實驗的影響。

3）優(yōu)化實驗操作。儀器均需預熱（例如分光光度計、離心機等）；顯色液需現(xiàn)配現(xiàn)用；待測液靜置時需嚴格避光；對氨基苯磺酸在常溫下難溶于水，應用熱水配制；泡菜制作時裝壇要均勻，測定時取樣要均勻。

4.2 實際生活 制作泡菜時，泡蘿卜宜加入0.9%食醋，泡白菜時宜加入0.6%濃度的食醋，泡豇豆時可根據(jù)個人喜好添加適量食醋；宜選用較高濃度食鹽水，加入適量姜和辣椒，密封泡菜壇且放置于陰涼處。綜合考慮3種泡菜亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時間，建議從第6天開始食用。3種泡菜比較而言，泡豇豆中亞硝酸鹽含量很低，且保存時間較長，因此豇豆是一種非常好的泡菜原料。