寧安鳳，董藝超，朱旗，毛麗梅，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.佳木斯大學生命科學院，佳木斯 154007；3.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；4.石家莊第六醫(yī)院，石家莊 050051)

稽留流產(chǎn)是一種特殊性的自然流產(chǎn)，又稱過期流產(chǎn)或死胎不下，是指妊娠20周之前胚胎或胎兒已死亡并滯留宮腔內(nèi)未能及時自然排出者[1]。近年來稽留流產(chǎn)的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，其絕對數(shù)逐年增加[2]。目前已知的病因中有遺傳性因素、感染性疾病、免疫功能異常、內(nèi)分泌失調以及孕婦年齡等[3-7]。盡管國內(nèi)外關于稽留流產(chǎn)的文獻報道不少，但其發(fā)病機制迄今未明。

MicroRNA(miRNA)是一類長度為20～24 nt的非編碼單鏈RNA分子，普遍存在于各種動植物體內(nèi)，其在細胞內(nèi)具有多種重要的調節(jié)作用[8-9]。MiR-30d是一個在生殖、發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用的基因[10-12]。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30d在大鼠胚胎植入時表達上調[13]。Cai等[10]的研究也顯示miR-30d表達上調有助于子宮內(nèi)膜接受態(tài)的形成，其表達下調可以破壞子宮內(nèi)膜接受態(tài)和抑制上皮細胞間質轉化。在胚胎植入過程中，母體子宮內(nèi)膜miR-30d表達升高可以增強小鼠胚胎粘附能力[14]。這些研究結果提示miR-30d過表達有助于胚胎植入的發(fā)生。胚胎植入異常是引起自然流產(chǎn)的原因之一，miR-30d是否與稽留流產(chǎn)發(fā)生相關尚未見報道。本研究通過定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)分析了miR-30d在人稽留流產(chǎn)胎盤絨毛組織中的表達模式，并利用原位雜交檢測了miR-30d的表達定位，為探索miR-30d在稽留流產(chǎn)中的作用奠定一定基礎。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年1月至2014年12月于石家莊第六醫(yī)院治療的80例稽留流產(chǎn)患者及同期該院1∶1匹配的正常人工流產(chǎn)孕婦為研究對象，分別為稽留流產(chǎn)組(80例)和對照組(80例)，收集絨毛組織。年齡20～40歲，孕周8～12 w。由于年齡是引起稽留流產(chǎn)的一個危險因素，將稽留流產(chǎn)組按照年齡不同分為4個亞組：年齡≤25歲組(Y≤25)、26～30歲組(Y 26～30)、31～35歲組(Y 31～35)、≥36歲組(Y≥36)。對照組根據(jù)稽留流產(chǎn)組的年齡進行1∶1匹配，每亞組稽留流產(chǎn)組和對照組各10例。排除染色體異常、生殖器官異常、感染性疾病、免疫功能異常和內(nèi)分泌失調。稽留流產(chǎn)的診斷依據(jù)《婦產(chǎn)科學》相關標準[1]。

二、方法

1.主要試劑： TRIzol reagent(Invitrogen，美國)、M-MLV reverse transcriptase(Promega，美國)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、FastStart Univel SYBR Green Master以及miRNA雜交液和地高辛抗體(Roche，德國)、miR-30d 地高辛探針(上海生工生物工程公司)、miR-30d qRT-PCR Primer Set(廣州RIBBIO公司)。

2.總RNA的提?。豪肨RIzol一步法提取絨毛組織總RNA，具體步驟如下：取50～100 mg絨毛組織加入1 ml TRIzol，先用滅菌剪刀將組織剪碎，再用勻漿器破碎組織，轉入Eppdoff管，加入0.2 ml氯仿充分混勻，室溫靜置2～3 min，4℃ 12 000 rpm離心15 min，取上清至新的Eppdoff管，加入2倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇清洗沉淀，4℃ 7 500 rpm離心5 min，棄掉乙醇，重復2次，沉淀室溫干燥，加入無核酸酶水溶解。

3.qRT-PCR：取1 μg Total RNA、M-MLV reverse transcriptase，miR-30d反轉錄引物、RNase inhibitor、dNTP mixture、10×buffer，按照說明書進行反轉錄，反應體系為10 μl。反應條件：30℃ 10 min，42℃ 1 h，85℃ 5 min。以反轉錄的cDNA作為模板，加入FastStart Universal SYBR Green Maste和miR-30d PCR引物(正向引物：5′-TGTAAACATCCCCGACTGGAAG-3′；反向引物：5′-ACAGACAGCATCACTCA-3′)，在ABI Prism 7500 Sequence Detection System進行qRT-PCR。反應體系為20 μl。擴增條件：95℃ 10 min，然后95℃ 15 s和60℃ 1 min，40個循環(huán)。U6作為內(nèi)參(正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)，用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達量。每個樣品至少3次重復，每次實驗重復3遍。

4.原位雜交：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇分級水化后用4%多聚甲醛后固定，蛋白酶K處理，然后置于預雜交液(50%去離子甲酰胺，5×SSC，120 μg/ml鮭魚精DNA)中，于42℃預雜交2 h，將地高辛標記的miR30d探針(5′-DIG-ctTccaGtcgGggAtgtTtaCa-3′)以400 ng/ml的濃度加入預雜交液中，40℃雜交過夜。2×SSC緩沖液中洗滌以除去非特異性結合的探針。用0.5% 封閉劑室溫孵育1 h，加入抗地高辛抗體孵育2 h，用NBT/BCIP顯色。清水終止顯色后封片。陰性對照是用地高辛標記的LNA-scrambled 探針進行雜交。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩組患者一般資料比較

稽留流產(chǎn)組和對照組患者的一般資料比較均無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

表1 兩組患者一般資料比較 (x-±s)

二、 miR-30d在稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達

1.稽留流產(chǎn)組和對照組中miR-30d的表達：將兩組患者絨毛組織樣本進行檢測并統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)miR-30d在稽留流產(chǎn)組絨毛組織中的表達有上調趨勢，但兩組間尚無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測miR-30d在兩組患者絨毛組織中的表達

2.miR-30d在稽留流產(chǎn)組不同年齡亞組絨毛組織中的表達：qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，miR-30d在Y≤25組患者絨毛組織中表達顯著下調(P<0.01)，在Y 26～30組患者絨毛組織中表達極顯著降低(P<0.01)，在Y 31～35組患者絨毛組織中表達上調(P<0.05)，在Y≥36組患者絨毛組織中表達沒有顯著變化(P>0.05)(圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 不同年齡亞組與對照組患者絨毛組織中miR-30d的表達

3.miR-30d在不同年齡段稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中表達的個體化差異：對miR-30d在不同年齡段稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達水平與1∶1匹配的對照組逐個進行比較發(fā)現(xiàn)，在Y≤25組中，70%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達顯著下調(P<0.01)；在Y 26～30組，100%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達顯著下調(P<0.01)；在Y 31～35組，30%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達顯著上調(P<0.01)，20%患者絨毛組織中miR-30d表達顯著下調(P<0.01)，其余患者miR-30d表達沒有顯著變化(P>0.05)；在Y≥36組，30%稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中miR-30d表達顯著上調(P<0.01)，40%患者絨毛組織中miR-30d表達顯著下調(P<0.01)，其余患者miR-30d的表達沒有顯著變化(P>0.05)(圖3)。

三、miR-30d在絨毛組織中的定位

由于miR-30d在30歲以下稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中表達為下調，30歲以上患者沒有明顯趨勢，因此，我們將兩組患者以30歲為界分成兩個亞組(Y≤30和Y≥31)，利用原位雜交方法分析miR-30d的表達定位。檢測結果顯示，在Y≤30的稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，miR-30d的陽性著色主要見于合體滋養(yǎng)層細胞，且其陽性信號強度明顯弱于對照組；在Y≥31的稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，miR-30d的陽性信號主要定位于合體滋養(yǎng)層細胞，和對照組的信號強度未見明顯差異(圖4)。

注：與匹配的對照組比較，**P<0.01圖3 不同年齡段稽留流產(chǎn)絨毛組織中miR-30d表達的個體化差異

圖4 原位雜交檢測miR-30d在絨毛組織中的定位(×100，箭頭示miR-30d陽性信號)

討 論

MiRNAs與稽留流產(chǎn)關系的研究剛剛起步，在NCBI、PubMed上搜索僅見一篇報道，miR-575異常表達可以通過調節(jié)細胞凋亡和血管發(fā)生參與稽留流產(chǎn)的發(fā)生[15]。國內(nèi)植枝福等[16]報道m(xù)iR-518在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織及血清中的表達明顯升高。目前，國內(nèi)外關于miRNAs與稽留流產(chǎn)關系的報道不多。由此可見，miRNAs與稽留流產(chǎn)的相關性遠未闡述清楚。

我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-30d在大鼠胚胎植入中表達顯著上調[13]，而胚胎植入的異常是引起稽留流產(chǎn)的一個重要原因，因此，本研究選擇miR-30d作為研究對象，利用已經(jīng)收集的稽留流產(chǎn)絨毛組織分析了miR-30d的表達模式。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-30d在Y≤25和Y 26～30組，無論是總體表達趨勢還是個體化分析均顯著下調；在Y 31～35組，總體趨勢表達上調，個體化分析沒有明顯規(guī)律；在Y≥36組，總體趨勢和個體化分析均未見明顯差異。MiR-30d在稽留流產(chǎn)患者30歲前后的變化趨勢不一致可能主要是由于隨著年齡的增長基因發(fā)生改變[17]，人的個體化差異就越大，不容易發(fā)現(xiàn)一致性規(guī)律。植枝福等[16]利用qRT-PCR檢測稽留流產(chǎn)患者胎盤和血液miR-518表達，發(fā)現(xiàn)其顯著上調，推測其可能與稽留流產(chǎn)的發(fā)病相關。miRNA的表達變化在一定程度上可能反映了其與疾病的相關性。MiR-30d在稽留流產(chǎn)患者胎盤組織中表達下調，而其在胚胎植入時表達上調，我們推測miR-30d表達下調可能引起胚胎植入異常，不利于胎盤的形成，進而引起稽留流產(chǎn)。

原位雜交結果顯示miR-30d主要定位于合體滋養(yǎng)層細胞。合體滋養(yǎng)層細胞位于絨毛最表層，直接與母體血液相接觸，是母體血液與胎兒血液物質交換的前沿，構成母胎循環(huán)的屏障，保護胎兒免受母體有毒有害物質的損傷[18]。合體滋養(yǎng)層細胞除具有活躍的吸收和轉運營養(yǎng)物質的功能外，還具有分泌大量對胚胎發(fā)育和維持妊娠所必需的多種激素和細胞因子的作用，保護胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的損傷，有利于胎兒在宮腔內(nèi)生長發(fā)育[19-22]。MiR-30d在小于30歲的稽留流產(chǎn)患者合體滋養(yǎng)層的陽性信號弱于正常妊娠者，這提示miR-30d低表達可能不利于滋養(yǎng)層細胞發(fā)揮正常功能，影響胎兒發(fā)育，進而引起胚胎停育和稽留流產(chǎn)。

綜上所述，miR-30d在小于30歲稽留流產(chǎn)患者胎盤合體滋養(yǎng)層中表達下調，可能不利于胎盤的發(fā)育，這可能是引起稽留流產(chǎn)的原因之一。對miR-30d在稽留流產(chǎn)中表達模式的研究將為深入探討miRNAs在稽留流產(chǎn)中的作用提供有價值的資料，也可能為稽留流產(chǎn)的早期預警提供有潛在價值的分子靶標。