高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中6種合成著色劑

李明暉

摘 要：建立了一種同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中胭脂紅、莧菜紅、日落黃、檸檬黃、亮藍(lán)以及誘惑紅的高效液相色譜法。本方法先用石油醚-乙醚混合液除去樣品中的油脂，再用95%的乙醇溶液浸提，結(jié)合聚酰胺吸附法提取，制成水溶液，高效液相色譜法254nm、625nm兩個(gè)波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定6種合成著色劑。結(jié)果表明：采用該方法6種合成著色劑在濃度1.0～30.0μg/ml有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999；方法檢出限為檸檬黃0.5mg/kg、莧菜紅0.5mg/kg、胭脂紅0.5mg/kg、日落黃0.5mg/kg、亮藍(lán)0.2mg/kg、誘惑紅0.5mg/kg；回收率可達(dá)到81.0%～96.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于6.4%。

關(guān)鍵詞：糕點(diǎn)；同時(shí)測(cè)定；合成著色劑；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：TB 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2018.33.093

0 前言

中國(guó)有一句話說(shuō)的是色、香、味俱全，是對(duì)這道菜最好的評(píng)價(jià)。糕點(diǎn)也不例外，“色”排在首位，作為糕點(diǎn)中最重要的感官指標(biāo)之一，色澤直接影響到消費(fèi)者的食欲。許多商家為了從感官上吸引客戶的眼球，除了在加工工藝等方面改進(jìn)產(chǎn)品的色澤外，還會(huì)通過(guò)添加人工合成著色劑來(lái)增加產(chǎn)品的色澤。較天然色素，人工合成色素顏色更加鮮艷，不易褪色，且價(jià)格較低。因此，糕點(diǎn)生產(chǎn)企業(yè)存在超量超范圍添加人工合成著色劑的情況，長(zhǎng)期食用此類產(chǎn)品將嚴(yán)重危害人體健康。英國(guó)多動(dòng)癥兒童治療中心的專家們指出，食用色素不僅影響兒童的生理和心理健康，使他們情緒失控，出現(xiàn)大哭大叫、失眠等狀態(tài)，還會(huì)對(duì)某些過(guò)敏體質(zhì)的成年人產(chǎn)生影響，使他們出現(xiàn)易怒等情緒不穩(wěn)定的狀況。

根據(jù)筆者近幾年的工作經(jīng)歷，在糕點(diǎn)的日常監(jiān)督檢驗(yàn)和型式試驗(yàn)中涉及的人工合成著色劑多為胭脂紅、莧菜紅、日落黃、檸檬黃、亮藍(lán)以及誘惑紅，這6種合成著色劑現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)方法為GB 5009.35-2016和GB 5009.141-2016，其中GB 5009.35-2016方法定性定量準(zhǔn)確但其適用范圍并未包含糕點(diǎn)，而誘惑紅的檢驗(yàn)方法GB 5009.141-2016試驗(yàn)步驟繁瑣復(fù)雜，本方法先用石油醚-乙醚混合液除去樣品中的油脂，再用95%的乙醇溶液浸提，結(jié)合聚酰胺吸附法提取，制成水溶液，高效液相色譜法測(cè)定，建立了一種同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中胭脂紅、莧菜紅、日落黃、檸檬黃、亮藍(lán)以及誘惑紅的高效液相色譜法，取得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

供試的10種糕點(diǎn)均為市售的普通糕點(diǎn)。

1.2 試驗(yàn)儀器與試劑

試驗(yàn)基本儀器為高效液相色譜儀1260（二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）儀器條件為：色譜柱：Welch Ultimate XB C18（4.6×150 mm，5μm）；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃；二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)：254 nm，625nm。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。電子天平ME204E（0.0001g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），渦旋混合儀（江蘇金壇市中大儀器廠），低速離心機(jī)（上海安亭）。

試驗(yàn)主要試劑為甲醇（色譜純，CNW）、乙腈（色譜純，CNW），聚酰胺粉、氨水（分析純）、甲酸（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）、石油醚（分析純）、乙醚（分析純）、檸檬酸（分析純）、乙酸銨（分析純）、乙酸（分析純）以上試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑分析有限公司。胭脂紅、莧菜紅、日落黃、檸檬黃、亮藍(lán)（墨質(zhì)檢壇，濃度0.5mg/mL），誘惑紅（墨質(zhì)檢壇，濃度1.0mg/mL）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 測(cè)定方法

稱取5g左右已經(jīng)粉碎均勻的樣品于離心管中，加入50mL石油醚-乙醚（V∶V=1∶1）漩渦震蕩后離心，棄去上清液，待有機(jī)試劑揮發(fā)干，再加入30mL 95%乙醇溶液，旋渦震蕩，置于60～70℃恒溫水浴超聲儀中反復(fù)超聲浸提，合并浸提液，加入檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH到6左右，加熱至60℃，加入1g聚酰胺粉調(diào)成糊狀攪拌均勻，以垂融漏斗抽濾，用60℃pH=4的溫水洗滌數(shù)次，然后用甲醇-甲酸混合溶液（V∶V=6∶4）洗滌數(shù)次，再用水沖洗至中性，用無(wú)水乙醇-氨水-水混合溶液（V∶V∶V=7∶2∶1）解吸數(shù)次，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發(fā)近干，加水溶解，定容至5.00 ml，過(guò)0.45μm水相濾膜，待測(cè)。采用上述方法，對(duì)10種糕點(diǎn)中6種合成著色劑含量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定 3 次。

1.3.2 方法驗(yàn)證

通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)和添加回收試驗(yàn)對(duì)測(cè)定方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。（1）重復(fù)性驗(yàn)證 ：取有檢出著色劑糕點(diǎn)樣品5g，按照試驗(yàn)方法處理，平行樣品5個(gè)，對(duì)各色素進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算RSD。（2）添加回收試驗(yàn)： 取其中一個(gè)糕點(diǎn)樣品5 g，平行測(cè)定6次，根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)中糕點(diǎn)各色素成分含量，選取5.0 mg/kg，10.0 mg/kg，30.0 mg/kg作為加標(biāo)量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率。（3）檢出限試驗(yàn)：稱取5g的陰性糕點(diǎn)樣品，按照建立的方法平行測(cè)定11次。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線制作

吸取胭脂紅、莧菜紅、日落黃、檸檬黃、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00mL、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL，用水定容于10mL容量瓶中，配置成50μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取50.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋成1.00μg/ml，5.00μg/ml，10.0μg/ml，20.0μg/ml，30.0μg/ml五個(gè)濃度，按照上述色譜條件進(jìn)樣，以各色素峰面積對(duì)濃度做線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理的優(yōu)化

本方法根據(jù)糕點(diǎn)中含糖量、蛋白質(zhì)、脂肪等較高，基質(zhì)較復(fù)雜的特點(diǎn)，采用石油醚-乙醚混合溶液浸提除去脂肪，加入95%乙醇溶液加熱超聲浸提后，結(jié)合聚酰胺粉吸附法進(jìn)行提取色素克服了水溶液-聚酰胺粉吸附法在操作過(guò)程中難抽濾、樣品抱成團(tuán)的問(wèn)題，建立了一種糕點(diǎn)中著色劑測(cè)定的前處理方法。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

考察了甲醇、甲醇：乙腈（10∶1，5∶1，5；5，1∶5，1∶10）不同配比作為流動(dòng)相有機(jī)相條件下6種著色劑的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇：乙腈（v∶v=10∶1）為流動(dòng)相有機(jī)相，克服了糕點(diǎn)基質(zhì)、梯度洗脫帶來(lái)的基線不穩(wěn)，柱壓增大等問(wèn)題，基線更為平穩(wěn)，而且各色素分離度、出峰時(shí)間合理。本方法采用甲醇：乙腈（v∶v=10∶1）作為流動(dòng)相有機(jī)相。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用檢測(cè)器特有的可變波長(zhǎng)的功能，考察了多個(gè)波長(zhǎng)。綜合考慮，結(jié)合實(shí)際工作需要選出在254nm條件下測(cè)定檸檬黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、日落黃，625nm測(cè)定亮藍(lán)。254nm的條件下上述5種合成著色劑響應(yīng)值都較為理想，但是亮藍(lán)的響應(yīng)過(guò)?。ㄒ?jiàn)圖1，圖2）。625nm的條件下亮藍(lán)的響應(yīng)最大，干擾較小。

2.4 該方法測(cè)定6種合成著色劑的線性關(guān)系及標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

由表2可知，采用該方法測(cè)定糕點(diǎn)中6種合成著色劑，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系均良好， r值均大于0.9999；其中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅是254nm測(cè)定，亮藍(lán)625nm測(cè)定。

由圖1和圖2（橫坐標(biāo)為時(shí)間min，縱坐標(biāo)為響應(yīng)值mAU）可知，采用該方法6種合成著色劑分離度、出峰時(shí)間、峰型、響應(yīng)值都比較理想，滿足試驗(yàn)要求。

2.5 該方法測(cè)定10中糕點(diǎn)中6種合成著色劑含量

采用建立的方法，測(cè)定了市售的10種糕點(diǎn)中6種合成著色劑的含量，結(jié)果其中兩個(gè)品種糕點(diǎn)檢出檸檬黃分別為0.021g/kg、0.052g/kg，一個(gè)品種糕點(diǎn)檢出胭脂紅0.053g/kg。糕點(diǎn)中檸檬黃和胭脂紅兩種著色劑在GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中指標(biāo)為不得添加。這幾種著色劑超標(biāo)的糕點(diǎn)相較其他品種顏色均較為鮮艷。因此，建議廣大消費(fèi)者在購(gòu)買糕點(diǎn)時(shí)慎重選擇顏色艷麗的品種。

2.6 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.6.1 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性結(jié)果顯示，RSD為4.9%，這說(shuō)明試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.6.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

由表3可知，加標(biāo)回收率為81.0%～96.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于6.4%，表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

2.6.3 檢出限試驗(yàn)

采用3倍基線噪聲水平作為檢出限，則本方法的檢出限為檸檬黃0.5mg/kg、莧菜紅0.5mg/kg、胭脂紅0.5mg/kg、日落黃0.5mg/kg、亮藍(lán)0.2mg/kg、誘惑紅0.5mg/kg，滿足試驗(yàn)要求。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)，利用檢測(cè)器特有的可變波長(zhǎng)的功能，多波長(zhǎng)下測(cè)定，通過(guò)對(duì)前處理和流動(dòng)相的優(yōu)化，克服了糕點(diǎn)中著色劑測(cè)定中遇到的基質(zhì)大，難處理等干擾，建立了一種同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中6種合成著色劑的分析方法。結(jié)果表明，該方法的線性范圍、回收率、檢出限、精密度均可滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的要求。值得注意的是，本文研究未涉及糕點(diǎn)彩妝以及糕點(diǎn)中的餡料。此類糕點(diǎn)在運(yùn)用該方法進(jìn)行測(cè)定的時(shí)候，在樣品前處理方面還需參照其他方法，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

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