程實(shí) 應(yīng)金威 文天用 裴世深 蘇凌浩 王德利 阮狄克**

（1.海軍總醫(yī)院骨科，北京 100048；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，廣東 深圳 518035）

椎間盤退行性疾病是引起臨床下腰痛癥狀的重要病因之一，多種因素在椎間盤退變的過程中發(fā)揮作用[1]。目前認(rèn)為椎間盤退變始于髓核，髓核細(xì)胞數(shù)量減少及功能失調(diào)是導(dǎo)致椎間盤退變的重要原因之一[2]，因此多數(shù)研究也都圍繞髓核展開。在各種針對椎間盤退變的生物學(xué)治療手段中，間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有自我復(fù)制和多系分化能力而在椎間盤退變修復(fù)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力[3,4]。近年研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，髓核組織內(nèi)存在髓核間充質(zhì)干細(xì)胞（nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPSCs），并且在維持髓核組織正常功能及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)，退變及衰老個(gè)體的椎間盤內(nèi)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力減弱，無法繼續(xù)發(fā)揮作用。因此，通過激活NPSCs向類髓核細(xì)胞分化以達(dá)到組織的自我修復(fù)是理想的治療方法。骨形態(tài)生成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）和轉(zhuǎn)化生長因子β3（transforming growth factorβ3,TGF-β3）都可以促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)軟骨相關(guān)基因，在調(diào)控干細(xì)胞向類軟骨細(xì)胞分化及代謝中具有重要作用[8,9]。目前關(guān)于兩者對于誘導(dǎo)NPSCs向類髓核細(xì)胞分化的作用及其最佳條件的報(bào)道較為少見。本實(shí)驗(yàn)旨在研究聯(lián)合應(yīng)用BMP-2和TGF-β3對NPSCs向類髓核細(xì)胞分化的作用，為進(jìn)一步應(yīng)用NPSCs修復(fù)椎間盤退變打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

3月齡健康雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量約330～350 g，均由海軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物處理方案符合倫理要求。

1.2 髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

經(jīng)腹腔過量注射10%水合氯醛處死SD大鼠，70%酒精浸泡消毒后切除鼠尾，無菌刀片切開纖維環(huán)，顯微鏡下分離髓核組織，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加PBS漂洗3次去除血污，于六孔板內(nèi)將髓核組織切成1 mm3的小塊，加入2 mlⅡ型膠原酶消化4 h，終止消化，離心后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10%血清DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，6 h后棄培養(yǎng)基及未貼壁的細(xì)胞，此后每3 d換液一次，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，待融合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化后按1∶3比例傳代，取P3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 三系分化實(shí)驗(yàn)

取P3代NPSCs，分別加入成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（賽業(yè)生物科技公司，中國）誘導(dǎo)21 d，21 d后收集細(xì)胞分別進(jìn)行油紅O、茜素紅、阿利新藍(lán)染色觀察分化效果。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞表型表達(dá)情況

取P3代NPSCs，消化后重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，取100μl細(xì)胞懸液加入熒光標(biāo)記抗體CD73、CD90、CD105及 CD34、CD45（Abcam公司，美國），染色30 min后上流式分析儀進(jìn)行檢測（BD，San Jose，CA，USA）。

1.5 C C K-8實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期NPSCs，3000個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，每組樣本均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分為對照組、TGF-β3組（20 ng/ml，Prospec公司，以色列）、BMP-2組（100 ng/ml，Prospec公司，以色列）和20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2組。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1、3、5、7 d，終止培養(yǎng)后PBS洗3次，每孔加入含10μl CCK-8試劑（Dojindo，日本）的培養(yǎng)基 110 μl，孵育1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm測定各孔吸光度（OD）值，取5孔平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 誘導(dǎo)N M P S C s向類髓核細(xì)胞分化后阿利新藍(lán)染色

取P3代NPSCs，按上述分組在培養(yǎng)基中加入不同組合細(xì)胞因子。誘導(dǎo)14 d后，取各組細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，加入多聚甲醛固定12 h，阿利新藍(lán)染液浸染4 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。使用Image-j軟件進(jìn)行定量分析。

1.7 R T- P C R檢測髓核特異基因的表達(dá)

分別在誘導(dǎo)7 d和14 d后取各組細(xì)胞，使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）提取各組細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，日本）按步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系為：cDNA模版1μl；上下游引物各1μl；反應(yīng)工作液10μl；無菌雙蒸水7μl；反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95℃30 s預(yù)變性，95℃10 s，56℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測目的基因?yàn)锳ggrecan、SOX-9、Collagen-2、Krt19，內(nèi)參基因?yàn)镚ADPH，各引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 P C R引物序列表

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件（Chicago，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 .結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長狀況及三系分化結(jié)果

P3代細(xì)胞與原代細(xì)胞形態(tài)一致，呈長梭形生長，形態(tài)均一，狀態(tài)良好，折光性好。成功進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化，成骨誘導(dǎo)可見橘紅色礦質(zhì)結(jié)節(jié)，成脂誘導(dǎo)油紅O染色可見脂滴形成，成軟骨誘導(dǎo)（圖1）。

2.2 流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志物結(jié)果

圖1 細(xì)胞形態(tài)及三系分化結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞CCK-8增殖曲線

所獲NPSCs高表達(dá)干細(xì)胞陽性標(biāo)志物CD73、CD90、CD105，陽性率分別是97.26%～99.22%、98.0%～99.2%、95.33%～99.65%，陰性表達(dá)CD34、CD45，陰性率分別為1.51%～3.61%、2.89%～4.07%。

2.3 C C K-8檢測各組細(xì)胞增殖水平

CCK-8結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組從第3天開始其增殖水平高于對照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組3組內(nèi)增殖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）

2.4 R T- P C R檢測各組7 d及14 d髓核細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)

圖3 誘導(dǎo)7 d，RT-PCR檢測各組細(xì)胞髓核特異基因SOX-9、COL2、Aggrecan、Krt19的表達(dá)相對量

圖4 誘導(dǎo)14 d，RT-PCR檢測各組細(xì)胞髓核特異基因SOX-9、COL2、Aggrecan、Krt19的表達(dá)相對量

RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)7 d后，實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞標(biāo)志基因（SOX-9、COL2、Aggrecan、Krt19）的表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而3個(gè)實(shí)驗(yàn)組各個(gè)基因表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在誘導(dǎo)14 d后，實(shí)驗(yàn)組髓核細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)仍高于對照組，聯(lián)合使用TGF-β3和BMP-2組中各個(gè)基因的表達(dá)量明顯高于其他3組（P＜0.05，圖3～4）。

2.5 阿利新藍(lán)染色檢測細(xì)胞外基質(zhì)分泌

各組誘導(dǎo)14 d后，阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示，對照組僅有微弱的蛋白多糖分泌，實(shí)驗(yàn)組則均有大量蛋白多糖分泌，肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組藍(lán)染面積及程度均高于對照組，使用Image-J軟件定量分析后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組均較對照組染色更深，聯(lián)合使用TGF-β和BMP-2組較其他組藍(lán)染程度更深（P＜0.05），表明聯(lián)合組蛋白多糖的分泌更多，NPSCs分化更優(yōu)（圖5～6）。

3 討論

圖5 誘導(dǎo)14 d后阿利新藍(lán)染色結(jié)果

圖6 Image-J定量分析藍(lán)染程度

椎間盤是人體最大的無血管器官，其退變的一大特征是髓核細(xì)胞的減少，細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡[10]。近年來，研究熱點(diǎn)主要集中在利用細(xì)胞治療、基因治療、細(xì)胞因子治療、組織工程等方法修復(fù)椎間盤退變。其中，組織工程被認(rèn)為是最具有前景的治療方法[11]。在構(gòu)建組織工程髓核過程中，種子細(xì)胞及生長因子的選擇仍尚未確定并需要繼續(xù)探索。NPSCs是近年來新發(fā)現(xiàn)的存在于髓核組織內(nèi)的一類間充質(zhì)干細(xì)胞，相比利用其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等，NPSCs更能適應(yīng)退變椎間盤復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境。有學(xué)者比較NPSCs與BMSCs生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)NPSCs有更好的向類軟骨細(xì)胞分化能力[12]，此外，Han等[13]研究發(fā)現(xiàn)，相比脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，NPSCs在酸性環(huán)境下活性更優(yōu)。因此，利用髓核組織內(nèi)部存在的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)退變椎間盤具有天然優(yōu)勢。本研究分離大鼠尾椎髓核組織內(nèi)的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，通過三系分化及干細(xì)胞表型檢測，證實(shí)成功分離了NPSCs。

髓核細(xì)胞特性類似于軟骨細(xì)胞，但又有差別，研究[14]顯示，相對于軟骨細(xì)胞髓核細(xì)胞高表達(dá)keratin19（Krt 19），配對盒基因1（PAX1）等脊索細(xì)胞特征性表型分子，且高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子SOX-9，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如二型膠原COL2和蛋白多糖Aggrecan，而一型膠原COL1的表達(dá)較低。軟骨細(xì)胞COL1和COL2的表達(dá)明顯較高，而蛋白多糖的表達(dá)相對較低[15]。結(jié)合krt19、COL2、SOX-9及Aggrecan，可以將髓核細(xì)胞同軟骨細(xì)胞區(qū)分開，因此在本研究中選取krt19、COL2、SOX-9及Aggrecan作為向髓核細(xì)胞分化的標(biāo)志。

TGFb-3及BMP-2均屬于TGF-β超家族成員，能夠調(diào)控多種細(xì)胞生理功能，主要作用于細(xì)胞增殖及分化的進(jìn)程。Colomiber研究[16]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合TGF-β1和GDF5可以促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用BMP-3可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向類髓核細(xì)胞分化，聯(lián)合TGF-β則可以進(jìn)一步促進(jìn)髓核特異基因的表達(dá)。McCanless等[18]則利用藻酸鹽支架、間充質(zhì)干細(xì)胞和BMP-2復(fù)合構(gòu)建出組織工程髓核。這些研究都表明了TGF及BMP在誘導(dǎo)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化中的重要調(diào)控作用。與上述研究相比，本研究也觀察到類似現(xiàn)象，CCK-8及RT-PCR結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞因子都能夠促進(jìn)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并促進(jìn)其向類髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但是相比于單獨(dú)應(yīng)用TGF-β3或BMP-2，兩者聯(lián)合使用在誘導(dǎo)14 d時(shí)能夠明顯提高NPSCs髓核特異基因的表達(dá)，因此具有協(xié)同作用。

TGF-β3及BMP-2主要通過與細(xì)胞表面受體TGF-βR和BMPR結(jié)合發(fā)揮作用。兩種細(xì)胞因子與相應(yīng)細(xì)胞表面受體結(jié)合后均可激活下游smad蛋白的表達(dá)，TGF-β家族主要磷酸化激活smad2/3，而BMP家族主要磷酸化激活smad1/5/8。但是，兩種細(xì)胞因子能夠共同激活smad4的表達(dá)，當(dāng)兩種細(xì)胞因子同時(shí)作用時(shí)有協(xié)同刺激smad4表達(dá)的效應(yīng)[19]。此外，有研究[20]發(fā)現(xiàn)，TGF-β3與BMP-2聯(lián)合使用時(shí)能夠明顯促進(jìn)BMP-2受體BMPR-2的表達(dá)。故推測TGF-β3聯(lián)合BMP-2明顯提高NPSCs向類髓核細(xì)胞分化能力的機(jī)制可能與促進(jìn)smad4蛋白和BMPR-2的表達(dá)有關(guān)。

綜上，本研究成功分離NPSCs，并發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用TGF-β3及BMP-2較單獨(dú)使用能更有效誘導(dǎo)NPSCs向類髓核細(xì)胞分化。本研究存在局限之處，體外實(shí)驗(yàn)需要持續(xù)加入細(xì)胞因子，因此操作復(fù)雜且干擾因素多。除單獨(dú)細(xì)胞因子外，三維環(huán)境對干細(xì)胞成軟骨分化也有促進(jìn)作用，下一步我們將采用病毒轉(zhuǎn)染及三維支架材料進(jìn)一步促進(jìn)NPSCs向類髓核細(xì)胞分化。