脊髓損傷急性期內(nèi)源性酮體增加對脊髓損傷大鼠的保護(hù)作用研究*

張麗河 洪毅,2** 王方永,2 姜樹東,2 李想,2 劉介生,2

（1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京 100068；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院脊柱外科，北京 100068）

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）可造成不可逆性的神經(jīng)損傷，導(dǎo)致?lián)p傷水平以下的運動、感覺、自主神經(jīng)功能障礙，并伴隨繼發(fā)各種并發(fā)癥。當(dāng)前SCI尚無治愈方法，為了改善急性SCI的神經(jīng)功能，研究者們致力于多個領(lǐng)域探索[1]，包括手術(shù)減壓、藥物治療、低溫處理、促神經(jīng)再生等治療手段，但效果均欠理想。因而，探索治療SCI治療新策略有著愈發(fā)重要的意義。

1920年引入了高脂肪、低碳水化合物和適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的生酮飲食（ketogenic diet,KD），模擬人體在饑餓狀態(tài)時，由脂肪代謝產(chǎn)生的酮體作為能源物質(zhì)為重要器官供能的過程，最初用于兒童癲癇的預(yù)防性治療，其安全性和有效性已得到肯定[2,3]。KD在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用越來越多，在阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和SCI的嚙齒動物模型中[4-6]，KD能有效改善運動功能，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。近年來，Streijger等[4]進(jìn)行了KD對急性SCI運動功能恢復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，KD喂養(yǎng)后大鼠的前肢功能可獲得更好的恢復(fù)。郭超凡等[7]進(jìn)行臨床研究，初步證明對急性SCI患者進(jìn)行KD治療具有安全性和可行性。

生酮比率（ketone ratio,KR）系飲食中脂肪質(zhì)量與碳水化合物加蛋白質(zhì)質(zhì)量的比值[8,9]，比率越高生酮強度越強。據(jù)報道[10]，KD治療不僅表現(xiàn)為KR越高，酮體水平越高，更重要的是其控制癲癇發(fā)作更有效。迄今為止，尚無有關(guān)KD對胸脊髓損傷神經(jīng)的保護(hù)作用及與KR的相關(guān)性文獻(xiàn)報道。本研究主要致力于探索不同水平急性內(nèi)源性酮體增加對脊髓損傷組織的保護(hù)作用及與運動恢復(fù)之間的關(guān)系，為進(jìn)一步實驗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只成年雌性SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。買入后適應(yīng)實驗室環(huán)境4 d，隨機分為3組，每組12只。A組大鼠攝入標(biāo)準(zhǔn)飼料，B組和C組大鼠分別攝入KR為3.1∶1和6.1∶1的生酮飼料，3組大鼠進(jìn)食熱量一致。本研究飼料均由南通特洛菲有限公司配制，對照組和實驗組飼料能量分布及脂肪酸構(gòu)成分別如表1和表2所示。于造模前1周給予相應(yīng)的飲食預(yù)處理，每日分3次填加飼料，及時清理盤中殘余飼料。

1.2 實驗試劑

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（顯色法），兔抗神經(jīng)絲蛋白(neurofilament,NF)-200單克隆抗體(1∶100)，抗熒光衰減封片劑，DAB濃縮型試劑盒，4%多聚甲醛，PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)，由北京奧博特生物科技有限公司提供。大鼠酮體ELISA試劑盒（北京冬歌生物科技有限公司）。青霉素(80萬U/支，江西省科達(dá)動物藥業(yè)有限公司)。

1.3 模型制備

本研究操作均采用盲法。大鼠術(shù)前禁食12 h，稱重，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉。以大鼠胸10棘突為中心，嚴(yán)格無菌操作下行背部皮膚縱行切口，沿棘突分離椎旁肌肉，剝離附著于棘突和椎板上的軟組織，顯露椎板，咬除胸10椎板，于胸10椎骨節(jié)段施行椎板切開手術(shù)，打開椎管，暴露胸10脊髓節(jié)段，為了避免血管、脊髓損傷，以上操作均在顯微鏡下進(jìn)行（奧林巴斯-SZ61）。在顯露的硬脊膜處，用小號無齒平鑷完全夾持大鼠胸10脊髓節(jié)段，持續(xù)15 s制造大鼠SCI模型[11]。造模成功后以生理鹽水沖洗傷口，徹底止血后逐層縫合肌肉、淺筋膜和皮膚。

表1 3組飼料能量分布

表2 3組飼料脂肪酸構(gòu)成（%）

1.4 術(shù)后護(hù)理

飼養(yǎng)溫度控制在22℃左右，定期通風(fēng)：12 h光照循環(huán)；定期更換墊料，保持籠內(nèi)干燥。術(shù)后每天2次行青霉素鉀肌肉注射，持續(xù)5 d。每日3次擠壓膀胱協(xié)助排尿，至恢復(fù)膀胱排尿反射；每日3次輕揉大鼠腹部及雙后肢，預(yù)防腸梗阻和壓瘡發(fā)生。

1.5 檢查方法

1.5.1 BBB評分：采用BBB行為評分法(Basso-Beattie-Bresnahan score,BBB)觀察大鼠后肢運動功能恢復(fù)情況[12]。于術(shù)后每周對各組大鼠進(jìn)行評分，評分在開放環(huán)境中進(jìn)行，每次評分均在晚上進(jìn)行，均保存錄像資料。主要根據(jù)實驗動物髖、膝、踝關(guān)節(jié)，行走、軀干運動、協(xié)調(diào)性情況進(jìn)行評分[12]。本實驗中采用雙人獨立觀察記錄，評分人員為熟悉評分規(guī)則的非本組實驗人員，最后結(jié)果取平均分。

1.5.2 血、尿酮體：于飲食干預(yù)前、飲食干預(yù)后第1、3、5、7、9周測定血清酮體和尿酮體水平。采用眼眶靜脈采血技術(shù)留取血液標(biāo)本[13]，尿液通過代謝籠分離出大便進(jìn)行收集。最后采用ELISA測量血清和尿液中β-羥丁酸（β-hydroxybutyrate，β-HB）的濃度。

1.5.3 運動誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP）檢測：采用Owen等[14]研究的經(jīng)椎板脊髓刺激技術(shù)。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下（30 mg/kg），采用神經(jīng)電生理儀(MEDELEC SYNERGY，德國)進(jìn)行檢測。刺激電極為兩對針狀電極，分別放置于手術(shù)野上、下棘突間隙，即T7/8和T11/T12，陰極置于陽極尾側(cè)，兩者間距0.5～1.0 cm。記錄電極也為一對針狀電極，先后于雙側(cè)小腿脛前肌記錄復(fù)合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）。參考電極置于大鼠腹部。刺激方法：間隔2 s刺激1次，刺激強度9.0 mA，記錄、分析MEP的振幅及潛伏期，并進(jìn)行比較。

1.5.4 組織病理學(xué)檢測：術(shù)后8周，將大鼠深度麻醉，經(jīng)心臟灌注取出脊髓損傷節(jié)段，每個標(biāo)本以損傷處為中心做連續(xù)切片，行HE染色、TUNEL凋亡檢測和NF-200免疫組織化學(xué)染色，每個指標(biāo)3張切片。

HE染色：常規(guī)HE染色，觀察實驗組和對照組損傷節(jié)段脊髓的局部大體形態(tài)變化。通過顯微鏡拍照，采集、分析樣本損傷部位脊髓組織的形態(tài)和損傷程度。

TUNEL檢測：TUNEL陽性細(xì)胞呈棕褐色。每張切片在200倍光鏡下選取3個視野，計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞，取平均值，計算陽性細(xì)胞率。

免疫組織化學(xué)染色：NF-200陽性細(xì)胞呈褐色，采集光學(xué)顯微鏡200倍視野下拍照，選取3個視野，測量分析樣本相關(guān)部位NF-200軸突計數(shù)，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因數(shù)方差分析（One-way ANOVA）。否則，采用秩和檢驗(Kruskal-Wallis One-Way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

大鼠SCI造模后所有受試大鼠活動量及飲食量均減少，并不同程度伴有腹部脹氣、大便困難伴硬結(jié)、尿潴留、雙后肢拖行等情況；少數(shù)大鼠出現(xiàn)血尿，規(guī)律人工擠尿后血尿好轉(zhuǎn)，個別大鼠出現(xiàn)自噬情況。整個實驗過程中2只大鼠因麻醉意外死亡，1只因誤吸死亡，其余大鼠均愈合良好，無感染（表3）。

表3 各組大鼠存活率比較

2.2 B B B評分比較

所有大鼠造模前BBB評分均為21分，造模后所有大鼠BBB評分均0分。隨著時間推移，運動功能緩慢恢復(fù)。3組大鼠術(shù)后1～8周BBB評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

2.3 血清酮體和尿酮體比較

飲食干預(yù)后實驗組大鼠血清酮體和尿酮體水平短期內(nèi)明顯升高。KD干預(yù)后，各檢測時間點3組大鼠血清酮體水平和尿酮水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，即C組血清酮體水平和尿酮水平顯著大于B組，B組顯著大于A組（圖2～3）。

2.4 M E P比較

術(shù)后8周，記錄3組大鼠MEP信號，分別比較3組大鼠的右側(cè)、左側(cè)和雙側(cè)后肢MEP的振幅和潛伏期，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。

2.5 3組組織病理學(xué)比較

圖1 3組大鼠術(shù)后BBB評分比較

圖2 3組大鼠血清酮體水平比較

圖3 3組大鼠尿酮體水平比較

2.5.1 HE染色：3組大鼠脊髓組織鉗夾區(qū)域脊髓組織切片HE染色結(jié)果（圖4）示，A組：白質(zhì)可見大量大小不等囊泡結(jié)構(gòu)，中央部分囊性擴(kuò)張形成空洞，脊髓灰質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，神經(jīng)元變性，前角可見少量殘存的神經(jīng)元；B組：脊髓組織血管豐富，白質(zhì)區(qū)疏松水腫，局部空泡變性，可見囊性擴(kuò)張；C組：灰質(zhì)白質(zhì)區(qū)可見，白質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)疏松水腫，局部空泡變性。由此可見，A組脊髓鉗夾區(qū)域脊髓組織破壞嚴(yán)重，B組和C組破壞程度相對較輕。

2.5.2 TUNEL凋亡細(xì)胞標(biāo)記染色：TUNEL檢測陽性細(xì)胞呈棕褐色，且只有細(xì)胞核被染色，細(xì)胞核內(nèi)棕褐色顆粒可在高倍鏡下觀察到。比較3組大鼠脊髓損傷節(jié)段神經(jīng)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，B組和C組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均低于A組大鼠（P＜0.05，圖5）。

2.5.3 NF-200免疫組織化學(xué)染色：3組均可見NF-200陽性表達(dá)細(xì)胞，神經(jīng)元胞體和軸突被染成褐色，主要分布在脊髓組織白質(zhì)損傷區(qū)域。比較3組間NF-200陽性細(xì)胞計數(shù)，B組和C組的NF-200陽性細(xì)胞計數(shù)顯著大于A組（P＜0.05，圖6）。

3 討論

大量研究證明，KD用于神經(jīng)退行性疾病、腦損傷和SCI等疾病可以達(dá)到神經(jīng)功能恢復(fù)的效果。我們首次探索KD對胸SCI的保護(hù)作用強度是否與KR大小有關(guān)，通過KR為3.1∶1和比值為6.1∶1的生酮飲食配方提前作用于胸SCI大鼠，使大鼠處于預(yù)防性的生酮代謝狀態(tài)，升高酮體及抑制SCI后繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的一系列病理變化。本研究觀察到KD干預(yù)后，酮體在短時間內(nèi)達(dá)到較高水平；大鼠的運動功能恢復(fù)緩慢，BBB評分未顯示出明顯的差異；KD干預(yù)能使大鼠脊髓變性程度減輕，增加脊髓組織保留，減少凋亡，或促進(jìn)軸突再生。因此，筆者認(rèn)為在一定程度上KD對SCI有神經(jīng)保護(hù)作用。

既往KD被大量用于兒童癲癇的研究及應(yīng)用，其控制癲癇的臨床療效毋庸置疑，目前有許多可選擇的KD，如經(jīng)典KD、中鏈甘油三酯飲食、改良阿特金斯飲食和低血糖指數(shù)治療[15]。其中經(jīng)典KD配方基于KR，臨床常用KD的KR為2～4∶1[10]。KR可能在KD的功效和耐受性中起重要作用[16]。據(jù)報道，隨著KR增大，KD的口感、耐受性越差，副作用越明顯[10,16]。廣泛使用KD可能導(dǎo)致早期出現(xiàn)胃腸道不適、酸中毒、低血糖等不良反應(yīng)，以及晚期的高脂血癥、腎結(jié)石等不良后果[17]。在眾多的不良反應(yīng)中，以胃腸道問題最為常見[18]。最新研究[19]表明，KD促進(jìn)脂蛋白大小和表型發(fā)生負(fù)面變化，有發(fā)生動脈粥樣硬化的風(fēng)險。這些不良影響需要在其出現(xiàn)之前預(yù)防，如應(yīng)用改良KD、減少促進(jìn)副作用發(fā)生或進(jìn)展的干預(yù)及定期檢測[19]。但在動物實驗領(lǐng)域，有研究對比KR從1∶1至9∶1的不同KD配方干預(yù)對大鼠的抗癲癇療效，得出一項關(guān)于劑量反應(yīng)療效與癲癇控制關(guān)系及其神經(jīng)毒性的報道[20]，KR為1∶1到9∶1的不同生酮配方，均未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)毒性及副作用，其中6∶1KD抗癲癇效果最佳，優(yōu)于4∶1或5∶1KD；飼喂1∶1KD的平均β-HB水平明顯低于3∶1～8∶1組，且9∶1KD喂食動物的β-HB水平顯著高于3∶1～6.3∶1組，但與8∶1KD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。迄今為止，尚無有關(guān)不同配方KD的劑量反應(yīng)療效與SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的實驗研究。因此，本實驗選用3.1∶1和6.1∶1的KD配方，以接近臨床應(yīng)用，控制不良反應(yīng)，并增大KR差距，更好識別不同KR飲食配方的治療療效。由此可見，SCI及KD喂養(yǎng)均可加重便秘，故本研究更加重視實驗動物術(shù)后腸道護(hù)理，并不限制水的攝入。

表4 3組大鼠 M E P振幅和潛伏期的分布情況

表4 3組大鼠 M E P振幅和潛伏期的分布情況

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圖4 術(shù)后8周，3組大鼠損傷節(jié)段脊髓組織大體形態(tài)（×40）

圖5 3組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

圖6 3組大鼠軸突計數(shù)比較

大鼠SCI模型制造有多種方法，其中挫傷和壓迫模型能更好地模擬人體損傷的生物力學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)變化[21]，而壓迫模型具有造模一致性、操作簡單、低成本、重復(fù)性好等優(yōu)點，通過調(diào)整鉗夾的夾力和時間的長短能復(fù)制出與臨床類似的SCI[22]，適用于受損脊髓神經(jīng)功能的研究和代謝改變的檢測[23]。本研究采用醫(yī)用無齒平鑷對大鼠T10脊髓節(jié)段進(jìn)行鉗夾壓迫模型制造[11]，將鑷子頭夾到底，造成嚴(yán)重的脊髓損傷。

運動功能是SCI后神經(jīng)功能評價的一項非常重要的內(nèi)容。1995年Basso、Beattie及Breshnahan研究制定了BBB行為功能評定量表[12]，該量表是目前評價截癱大鼠后肢運動功能較為準(zhǔn)確、可靠并且重復(fù)性高的運動行為學(xué)評定標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)報道[24]，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)有賴于神經(jīng)組織的可塑性，若存活的神經(jīng)纖維少于15%，則脊髓組織和高級中樞損傷區(qū)的可塑性便不能被證實。本研究結(jié)果顯示，3組大鼠運動功能在術(shù)后恢復(fù)較差且BBB評分無顯著性差異，考慮與本實驗?zāi)Ｐ洼^重及神經(jīng)可塑性差有關(guān)。

SCI后，運動傳導(dǎo)通路受損，導(dǎo)致MEP潛伏期和振幅改變。MEP刺激中樞神經(jīng)并在脊髓遠(yuǎn)端、周圍神經(jīng)或肌肉記錄信號，能直接反映脊髓下行運動傳導(dǎo)束的功能狀態(tài)，對判斷和評估運動功能恢復(fù)有著重要的參考意義[25]。MEP波形和幅度變化可以驗證飲食干預(yù)是否促進(jìn)SCI后脊髓運動傳導(dǎo)恢復(fù)。結(jié)果顯示實驗組在損傷后8周的MEP振幅大于對照組，但無顯著性差異，說明兩組運動傳導(dǎo)通路無顯著修復(fù)，運動功能在8周時改善不顯著。

急性SCI引發(fā)的繼發(fā)性損傷[26]，導(dǎo)致病變部位從神經(jīng)元細(xì)胞凋亡至完整白質(zhì)束漸進(jìn)性退化，初始損傷擴(kuò)大，明顯影響神經(jīng)損傷的程度。理論上，急性SCI的治療應(yīng)該提供神經(jīng)保護(hù)、增加可塑性以及軸突再生的措施。在飲食方面，KD是較為經(jīng)典的飲食調(diào)節(jié)方法[2,3,5,6]，被證明可通過廣泛細(xì)胞、分子機制發(fā)揮抑制活性氧產(chǎn)生、抗氧化、抗炎、抗凋亡及增加神經(jīng)可塑性等作用，達(dá)到對神經(jīng)組織的保護(hù)作用。有觀點認(rèn)為KD的一些功效是通過調(diào)節(jié)內(nèi)生酮水平發(fā)作用[4]。

有研究[27]證實繼發(fā)性SCI是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的結(jié)果。因此，有效的控制和阻斷細(xì)胞凋亡，對脊髓繼發(fā)性損傷的恢復(fù)起著重要作用。KD通過線粒體途徑能減少創(chuàng)傷性腦外傷幼鼠的細(xì)胞凋亡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)兩實驗組神經(jīng)細(xì)胞凋亡少，對照組脊髓側(cè)索部分神經(jīng)細(xì)胞凋亡，證明KD抗凋亡作用，但并未證明其與KR的具體關(guān)系，考慮與神經(jīng)可塑性破壞有關(guān)。

中樞神經(jīng)損傷后，NF-200的表達(dá)水平可反映神經(jīng)軸突損傷和修復(fù)的程度[29]。本研究選擇損傷節(jié)段脊髓作為觀測對象，能較好地反映神經(jīng)細(xì)胞在創(chuàng)傷后的修復(fù)反應(yīng)。通過比較NF-200陽性細(xì)胞計數(shù)，得出兩實驗組的NF-200陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量明顯多于對照組，與TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果相一致。說明KD療法可能通過促進(jìn)損傷部位脊髓內(nèi)軸突的再生，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，KR越高，酮體升高效果越好；KD能減輕脊髓組織的病理損傷程度，增加脊髓組織保留，對SCI具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用；KD療法不能有效改善重度胸段SCI大鼠后肢運動功能，未得出運動功能恢復(fù)與KR的確切關(guān)系。這種保留脊髓損傷組織的飲食干預(yù)為SCI后促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)提供了一個潛在方案，但關(guān)于其作用機制及合適的KR有待進(jìn)一步研究與探討。