李 釩 ，周 平 ，張文靜 ，王繼紅

（1.天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402；2.河北賽瑞德化工有限公司，河北滄州 061108；3.北京科潤(rùn)天朗環(huán)境技術(shù)有限公司，北京 105509）

化學(xué)農(nóng)藥的使用有利于農(nóng)作物的生長(zhǎng)及控制病蟲(chóng)害，保證了農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)效益最大化，但同時(shí)也可能帶來(lái)不可預(yù)測(cè)的負(fù)面影響，如造成生態(tài)環(huán)境中非靶標(biāo)生物的減少甚至滅絕，通過(guò)食物鏈的傳遞作用對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。因此，新型農(nóng)藥在產(chǎn)業(yè)化之前必須進(jìn)行生態(tài)安全性評(píng)價(jià)，以確保農(nóng)藥使用的安全性、合理性[1]。

藻類(lèi)處于食物鏈的底端，對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的影響較大。本文以非靶標(biāo)藻類(lèi)斜生柵藻為毒性指示生物，依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270—2014）[2]，探究20%異唑草酮懸浮劑對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制情況，為新型農(nóng)藥的安全使用提供重要的科學(xué)依據(jù)。斜生柵藻具有對(duì)毒性敏感，藻種易得，繁殖較快，個(gè)體較小等特點(diǎn)，適合作為新型農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)的測(cè)試生物[3-4]。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 供試農(nóng)藥

1.2 供試生物

試驗(yàn)用藻為斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供。該試驗(yàn)用藻由實(shí)驗(yàn)室自行培養(yǎng)，試驗(yàn)前對(duì)藻進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，使藻達(dá)到同步生長(zhǎng)階段。選用水生4號(hào)培養(yǎng)基，按照各組分配比由實(shí)驗(yàn)室自行配制，配方見(jiàn)表1。

圖1 異 唑草酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 水生4號(hào)培養(yǎng)基的配方

1.3.1 預(yù)培養(yǎng)

試驗(yàn)用藻每隔96 h接種1次，共接種3次，使藻達(dá)到同步生長(zhǎng)階段，以此作為試驗(yàn)用藻。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 供試溶液配制

1.3.2.2 供試藻液配制

將培養(yǎng)好的處于同步生長(zhǎng)階段的藻液取樣放在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，并根據(jù)藻細(xì)胞濃度將藻液稀

土壤提取液：取未施過(guò)肥的花園土200 g，置于三角瓶中，加入蒸餾水1 000 mL，瓶口用透氣塞封口。在100℃水浴中加熱3 h，冷卻24 h，此過(guò)程連續(xù)進(jìn)行3次。過(guò)濾，取上清液，采用高壓滅菌鍋滅菌，并于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

水生4號(hào)培養(yǎng)基用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，經(jīng)高壓滅菌（121℃，15 min）后，密封并貼好標(biāo)簽，4℃冰箱保存，有效期2個(gè)月。該培養(yǎng)基用高壓滅菌（121℃，15 min）的蒸餾水稀釋10倍后即可使用。

1.3 試驗(yàn)方法

釋成1.0×104個(gè)/mL供試藻液。

1.3.3 染毒操作

150 mL錐形瓶中裝入50 mL供試藥液，再接種50.0 mL同步生長(zhǎng)的藻液，振蕩混勻，得到異唑草酮質(zhì)量濃度為11.5 μg/L、23.0 μg/L、46.0 μg/L、92.0 μg/L、184.0 μg/L的5組處理藻液，培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)階段相同，并以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，對(duì)照組和各濃度藻液均設(shè)3次平行試驗(yàn)。

試驗(yàn)周期為72 h，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)及以后每隔24 h（0 h、24 h、48 h、72 h）測(cè)定容器中藥液的pH值，從各濃度組的每個(gè)重復(fù)中取40.0 mL供試物溶液于冰箱中保存，用于供試物含量的測(cè)定。

1.3.4 觀察方法

分別于試驗(yàn)開(kāi)始后的24 h、48 h、72 h，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 中毒癥狀

試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，未出現(xiàn)中毒癥狀，其他各濃度處理組均有一定程度的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，并出現(xiàn)藻細(xì)胞碎片、藻細(xì)胞體積膨脹、畸形分裂等現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)受到的影響越大，中毒現(xiàn)象越嚴(yán)重。綜上，異唑草酮對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，且質(zhì)量濃度越高，抑制作用越明顯。因此，在異唑草酮使用過(guò)程中，要控制其濃度，以避免對(duì)藻類(lèi)的傷害。

2.2 20%異唑草酮懸浮劑對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)抑制率

根據(jù)不同質(zhì)量濃度藥液72 h的生物量平均值，計(jì)算得到不同濃度藥液對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)抑制率和生物量抑制率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，異唑草酮對(duì)斜生柵藻的抑制作用明顯，生長(zhǎng)抑制率和生物量抑制率均隨其質(zhì)量濃度的增加而增大。因此，異唑草酮在使用過(guò)程中一定要控制好使用濃度，盡可能避免與藻類(lèi)接觸。藻類(lèi)受到傷害，則會(huì) 對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)造成很大影響[5]。

表2 20%異唑草酮懸浮劑對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果

表2 20%異唑草酮懸浮劑對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果

質(zhì)量濃度/(μ g·L-1) 序號(hào)中毒癥狀2 4 h 4 8 h 7 2 h 1 1.5 1 無(wú)明顯癥狀 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片2 無(wú)明顯癥狀 體積膨脹 有細(xì)胞碎片3 無(wú)明顯癥狀 有細(xì)胞碎片 體積膨脹2 3.0 1 有細(xì)胞碎片 體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹2 有細(xì)胞碎片 有細(xì)胞碎片 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹3 體積膨脹 體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹4 6.0 1 體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹2 有細(xì)胞碎片 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 體積膨脹，且畸形分裂3 體積膨脹 體積膨脹，畸形分裂 體積膨脹，且畸形分裂9 2.0 1 有細(xì)胞碎片 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹2 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹3 有細(xì)胞碎片 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹1 8 4.0 1 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹、畸形分裂 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹、畸形分裂2 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹、畸形分裂 有細(xì)胞碎片，且畸形分裂3 有細(xì)胞碎片 體積膨脹，且畸形分裂 有細(xì)胞碎片，且體積膨脹

表3 不同濃度藥液對(duì)斜生柵藻72 h的生長(zhǎng)抑制率和生物量抑制率結(jié)果

2.3 20%異 唑草酮懸浮劑對(duì)藻類(lèi)的毒性

根據(jù)20%異 唑草酮懸浮劑對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)藻類(lèi)生物量抑制率計(jì)算半效應(yīng)濃度EyC50，通過(guò)藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制率計(jì)算半效應(yīng)濃度ErC50。異唑草酮對(duì)斜生柵藻的EyC50值為26.7 μg/L，95%置信限為22.6～31.5 μg/L；對(duì)斜生柵藻的ErC50值為119.0μg/L，95%置信限為96.0～147.0μg/L。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270—2014）中農(nóng)藥對(duì)藻類(lèi)的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)（表4），判定20%異唑草酮懸浮劑對(duì)斜生柵藻高毒。因此，該農(nóng)藥在配制和使用過(guò)程中應(yīng)避免與河流、湖泊、海水等水體資源接觸，防止對(duì)水源產(chǎn)生污染和對(duì)藻類(lèi)產(chǎn)生傷害。

表4 農(nóng)藥對(duì)藻類(lèi)的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

3 小結(jié)