李如美，戴 爭，李瑞娟，李丹丹，高宗軍

（山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，山東省植物病毒學重點實驗室，濟南 250100）

葉菌唑（metconazole）是一種對非靶標生物毒性低，揮發(fā)性小，用量少，殺菌活性高的新型、廣譜、內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，可有效防治小麥赤霉病、白粉病以及銹病等禾谷類作物病害。葉菌唑是生產(chǎn)上控制小麥病害的重要殺菌劑品種[1-2]。小麥作為重要的糧食作物，在中國人餐桌上的呈現(xiàn)形式多種多樣。因此，優(yōu)質(zhì)小麥種植的意義深遠，小麥的安全生產(chǎn)備受關注。實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)小麥的無公害生產(chǎn)，提高國際市場的競爭力，增加農(nóng)民收入，是我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。目前，國內(nèi)外針對葉菌唑的殘留分析報道多關于肉類、水果及谷物，檢測方法主要包括氣相色譜-氮磷檢測器法、氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[3-6]。本研究以小麥為試驗對象，建立乙腈超聲離心法、二氯甲烷萃取法2種提取方法，通過高效液相色譜探索方法的可行性，為小麥植株中葉菌唑的測定提供更多的方法選擇。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；BHWY-2102C變頻搖床，寧波賽福實驗儀器有限公司；Z326K高速冷凍離心機，德國HERMLE公司；SQP百分之一電子天平、BSA224S-CW萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司。

葉菌唑標準品（99.5%），Dr.Ehrenstorfer公司；葉菌唑原藥（95%），江蘇耕耘化學有限公司提供；丙酮（色譜純），美國TEDIA公司；乙腈（色譜純），禹王試劑，山東禹王和天下新材料有限公司；二氯甲烷（分析純），天津市富宇精細化工有限公司；純水。

1.2 標樣溶液的配制

準確稱取0.010 1 g葉菌唑標準品于100 mL棕色容量瓶中，色譜純甲醇溶解定容，配制成100 mg/L葉菌唑標樣儲備液，再用色譜純甲醇梯度稀釋配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mg/L的標樣工作溶液。

1.3 小麥樣品的前處理

1.3.1 乙腈超聲離心法

用百分之一電子天平稱取10.00 g經(jīng)勻漿處理的小麥植株漿液，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，經(jīng)超聲提取，高速冷凍離心機以4 000 r/min離心處理5 min。取上清液至100 mL具塞量筒，重復3次，過濾合并3次離心所得上清液。向具塞量筒中加入7 g無水氯化鈉，振蕩2 min，靜置1 min，再振蕩1 min，靜置40 min。取30 mL提取液于50 mL雞心瓶中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋轉(zhuǎn)濃縮近干，用正己烷＋丙酮（體積比95∶5）定容至5 mL，待凈化。

1.3.2 二氯甲烷萃取法

稱取10.00 g經(jīng)勻漿處理的小麥植株漿液至100 mL分液漏斗中，向分液漏斗中加入20 mL二氯甲烷作為提取溶劑，機械振蕩5 min，靜置5 min，分出有機層。重復3次，合并3次提取液于100 mL雞心瓶中。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃旋轉(zhuǎn)濃縮近干，用正己烷＋丙酮（體積比95∶5）定容至5 mL，待凈化。

1.4 樣品的凈化

用5 mL正己烷＋丙酮（體積比95∶5）對Bond Elut Carbon固相萃取柱進行2次活化處理，再將固相萃取柱置于雞心瓶上，待凈化樣品經(jīng)渦旋振蕩器渦旋，轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，靜置5 min，再用5 mL上述正己烷＋丙酮溶液洗脫2次。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃旋轉(zhuǎn)濃縮近干，用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

1.5 儀器條件

Agilent 1260高效液相色譜儀，帶紫外檢測器；檢測波長：220 nm；流動相：甲醇＋水（體積比75∶25）；流速：1 mL/min；進樣體積：20 μL；柱溫：30℃；色譜柱：SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

對葉菌唑進行紫外全波長掃描，并對儀器出峰的靈敏度進行對比，選擇220 nm作為葉菌唑的檢測波長。流速相同，流動相中甲醇體積分數(shù)越小，保留時間越長，出峰越慢，且峰寬增加，峰高降低。試驗證明：甲醇＋水在體積比79∶21時，峰高適中；甲醇＋水在體積比為75∶25時，峰面積最大。綜合考慮出峰時間、峰形以及雜質(zhì)的影響，確定葉菌唑高效液相色譜最優(yōu)檢測條件為色譜柱SB-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇＋水（體積比75∶25），流速1 mL/min，檢測波長220 nm。

2.2 葉菌唑的標準曲線

制備0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L葉菌唑標樣溶液，經(jīng)高效液相色譜儀檢測分析，并以葉菌唑質(zhì)量濃度為橫坐標，對應色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1）。方法線性回歸方程為y=44.903 x＋1.448 8（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，葉菌唑質(zhì)量濃度為0.1～10.0 mg/L時，葉菌唑的質(zhì)量濃度與對應峰面積存在顯著線性關系，相關系數(shù)為0.999 9。

圖1 葉菌唑標準曲線

2.3 2種提取方式添加回收率測定

2.3.1 乙腈超聲提取法回收率測定結(jié)果

稱取小麥植株10.00 g，添加葉菌唑標樣溶液，使葉菌唑添加質(zhì)量分數(shù)分別為0.05、0.50、5.00 mg/kg，

每個處理設5次重復。按照1.3.1方法提取，并凈化，測定樣品中葉菌唑的質(zhì)量分數(shù)，計算添加回收率（見表1）。由表1可知，采用乙腈超聲離心法對小麥植株中葉菌唑進行提取，方法的平均回收率為90.40%～98.39%，相對標準偏差（RSD）為1.62%～5.10%。結(jié)果表明，本分析方法可滿足農(nóng)藥殘留分析要求。在此條件下，葉菌唑在小麥植株中的最低檢測質(zhì)量分數(shù)為0.05 mg/kg。

表1 乙腈超聲離心法對小麥中葉菌唑添加回收結(jié)果

2.3.2 二氯甲烷萃取法回收率測定結(jié)果

稱取小麥植株樣品10.00 g，添加葉菌唑標樣溶液，使葉菌唑添加質(zhì)量分數(shù)分別0.10、0.50、5.00 mg/kg，每個處理設5次重復。按照1.3.2方法提取，并凈化，測定樣品中葉菌唑的質(zhì)量分數(shù)，計算添加回收率（見表2）。由表2可知，采用二氯甲烷對小麥植株中葉菌唑進行萃取，方法的平均回收率為91.34%～95.00%，相對標準偏差為0.86%～3.89%。結(jié)果表明，該分析方法可滿足農(nóng)藥殘留分析要求。在此條件下，葉菌唑在小麥植株中的最低檢測質(zhì)量分數(shù)為0.10 mg/kg。

表2 二氯甲烷萃取法對小麥中葉菌唑添加回收結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜，以乙腈超聲離心法和二氯甲烷萃取法對樣品中葉菌唑進行提取，固相萃取柱凈化，SB-C18色譜柱分離測定葉菌唑在小麥植株中的殘留。該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，能排除雜質(zhì)干擾。