梅承翰，莊慧敏，劉師卜，牛厚菊，劉婷

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直接肽反應(yīng)試驗及其研究進展

梅承翰，莊慧敏，劉師卜，牛厚菊，劉婷

550016 貴陽，貴州省分析測試研究院應(yīng)用基礎(chǔ)研究室（梅承翰、牛厚菊）；550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)處統(tǒng)計室（莊慧敏）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院食品檢定所毒理功效實驗室（梅承翰、劉師卜、牛厚菊、劉婷）

變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是人類最常見的免疫毒性疾病之一。據(jù)估計 15% ~ 20% 的人會對一到多個市場中的化學(xué)品皮膚過敏[1]。支持皮膚致敏過程并最終導(dǎo)致 ACD 的關(guān)鍵機理事件已被闡釋清楚。經(jīng)濟與合作發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）報告中將其定義為有害結(jié)局通路（adverse outcome pathway，AOP）[2]。皮膚致敏性評價作為物質(zhì)安全性評價的重要組成部分并代表了化學(xué)品的技術(shù)標準。近年來，特別是歐洲國家，發(fā)展替代方法用以取代動物試驗的社會、科學(xué)和經(jīng)濟的壓力顯著增加。為此，眾多研究者開發(fā)基于肽或蛋白反應(yīng)活性的方法用以篩選并鑒定潛在皮膚致敏物質(zhì)，其中包括直接多肽反應(yīng)試驗（direct peptide reactivity assay，DPRA）。DPRA 立足于 AOP 中的分子起始事件，通過監(jiān)測待測物對半胱氨酸和賴氨酸多肽的消除從而評估待測物的致敏性，其準確度和靈敏度較高，并易于操作。2013 年歐洲替代方法研究中心將 DPRA 推薦為皮膚致敏試驗的方法，今已被 OECD 接受并公布[3]。該文將從 DPRA 的原理、局限性、優(yōu)化發(fā)展和與其他替代方法的整合等方面作詳細介紹。

1 基本原理

化學(xué)品與皮膚中蛋白的親核中心共價結(jié)合，此即為皮膚致敏有害結(jié)局通路中的分子起始事件，若無該事件，則皮膚致敏一般不會發(fā)生[4]。因此如化學(xué)品可直接或經(jīng)適當(dāng)生物轉(zhuǎn)化后與蛋白反應(yīng)，便具有潛在皮膚致敏性。上述反應(yīng)產(chǎn)物刺激朗格罕細胞從表皮向局部皮膚引流淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并將抗原呈遞至初始型 T 細胞，導(dǎo)致抗原特異性記憶 T 細胞克隆增殖，最終導(dǎo)致 ACD 臨床表征[5]。皮膚致敏物或其代謝產(chǎn)物的親電子性，使其可與含親核位點的蛋白反應(yīng)。DPRA 利用含半胱氨酸和賴氨酸的多肽作為親核試劑。待測物與上述多肽共孵育后，以高效液相色譜法檢測多肽的消除程度并以此來評估待測物的反應(yīng)能力。將多肽反應(yīng)數(shù)據(jù)與已有的局部淋巴結(jié)分析（local lymaph node assay，LLNA）數(shù)據(jù)作對比，并用遞歸區(qū)分方法建立分類樹，從而將反應(yīng)程度分為極小、低、中和高四等[6]。最后將極小反應(yīng)性歸為非致敏物，其他為致敏物。

2 直接肽反應(yīng)試驗的局限

盡管直接肽反應(yīng)試驗準確度高、靈敏度高，且便于批量化檢測，但仍存在局限。這些局限一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用，當(dāng)然這也是 DPRA 需要重點關(guān)注的地方。DPRA 以及許多其他用于皮膚致敏性評價的化學(xué)方法不能反映代謝活化或非生物轉(zhuǎn)化[7]，此為 DPRA 的主要缺陷之一。Pro-半抗原（pro-hapten）需要經(jīng)過酶介導(dǎo)活化后，才可形成蛋白反應(yīng)抗原，激發(fā)皮膚致敏。因而 DPRA 對于 pro-半抗原的致敏性預(yù)測存在困難，甚至無法預(yù)測。

直接肽反應(yīng)試驗對反應(yīng)的估計依賴于對未反應(yīng)多肽的檢測，并可能受到不同親水親核試劑和疏水致敏物的影 響[8]。大多數(shù)皮膚過敏原水溶性較差，因而在與另一溶液混合時，可能析出沉淀，從而影響對肽反應(yīng)的定量和結(jié)果分 級[9]。可見 DPRA 對待測物溶解性要求較高，此外溶劑的選擇也需考量并經(jīng)實驗驗證。同時 DPRA 對待測物濃度要求較高，在基于賴氨酸多肽（25 mmol/L）的檢測方法中尤為明顯，因而限制了高疏水性待測物的應(yīng)用[10]。DPRA 檢測中要求將待測物配制成 100 mmol/L 溶液，這在一定程度上限制了溶解性差的待測物的應(yīng)用。

DPRA 對于混合物特別是含未知成分混合物的致敏性預(yù)測存在困難。DPRA主要是針對單一化學(xué)品，而對復(fù)雜組分致敏性預(yù)測未有詳細界定和全方位評估。當(dāng)然 DPRA 也并非完全不能用于混合物，OECD TG442C 寫明了在針對成分已知的多組分時，需要根據(jù)各自組分的含量計算所需物質(zhì)的重量（單一純度）；或計算混合物表觀分子量，以評價混合物致敏性。另外對于無法確定分子量的聚合物，可考慮通過其單體分子量計算配制 100 mmol/L 溶液所需的量。有文獻報道，研究人員應(yīng)用 DPRA 對中藥注射劑和植物提取物進行致敏性評價[11-12]。該方法將中藥注射劑原液直接與多肽進行孵育，并未考慮混合物成分及其對應(yīng)濃度。一方面這是對 DPRA 應(yīng)用拓展的有益嘗試，另一方面也提示研究人員需要對 DPRA 應(yīng)用于復(fù)雜組分混合物作進一步評估。

3 直接肽反應(yīng)試驗的優(yōu)化

直接肽反應(yīng)試驗一經(jīng)推出，便受到廣大研究人員和相關(guān)產(chǎn)業(yè)人員的關(guān)注。雖然 DPRA 優(yōu)點明顯，潛力巨大，但仍有其局限。為此研究人員立足于肽反應(yīng)試驗的本質(zhì)，從多肽、代謝體系、檢測方法等方面進行探索和優(yōu)化，力圖建立高準確度、高靈敏度、特異性強和檢測快捷的肽反應(yīng)試驗方法。

HTS-DYCA（high throughput screening-dansyl cysteamine assay）是基于熒光半胱氨酸衍生物-新型化學(xué)高通量篩選方法對潛在皮膚親電子致敏劑進行快速識別的方法[8]。DYCA 直接在多孔微反應(yīng)板中對形成的半抗原-硫醇類蛋白質(zhì)加合物進行熒光檢測[8]。研究表明，在限定的致敏劑測試中，DYCA 和 DPRA 在準確度方面分別達到 81.8% 和 92.8%[8]。此外 DYCA 和 DPRA 均不能檢測出公認的 pre/pro-半抗原，如對苯二酚、間苯二酚和羥基酪醇[8]。此外，DYCA 對溶解度和氧化副反應(yīng)進行了優(yōu)化，并采用高通量化檢測以大幅縮短檢測時間[8]。

過氧化物酶肽反應(yīng)法（peroxidase peptide reactivity assay，PPRA）融合了劑量響應(yīng)分析、肽消除質(zhì)譜檢測和辣根過氧化物酶-過氧化氫酶（HRP/P）體系[13]，強化了對 pro/pre-半抗原的識別，調(diào)整和優(yōu)化了 DPRA。HRP/P 加入多肽孵育體系后，使 DPRA 檢測 pro-半抗原成為了可能。Troutman 等[7]研究表明，與 DPRA 相比，HRP/P 與 pre/pro-半抗原、半胱氨酸多肽共孵育，顯著增強了 4-羥基苯甲酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸丙酯的肽消除。酶介導(dǎo)激活 pro-半抗原后導(dǎo)致半胱氨酸多肽消除增加，最大消除值增加 20% ~ 100% 不等。然而對于 pre-半抗原，有無 HRP/P 加入，半胱氨酸多肽消耗無明顯差異。應(yīng)用 PPRA 對 70 個待測物進行評估，其準確度、靈敏度和特異性分別達到 83%、93% 和 64%[7]。然而待測物的溶解性和合適的測試濃度仍是 PPRA 面臨的難題和挑戰(zhàn)。替代方法對于識別致敏危害和提供正確的效力分級（弱、中等、強）都很重要。DPRA 和 PPRA 均可能有助于致敏效力評估，如提供整合方法、根據(jù)致敏物 GHS（Globally Harmonized System）分類或根據(jù)評估目的來確定致敏效力等[4]。此外也有研究人員將 PPRA 用于預(yù)測呼吸道致敏物。研究發(fā)現(xiàn)，PPRA 對具有內(nèi)在活性的呼吸道致敏物的預(yù)測與 DPRA 類似，但未能將呼吸道 pre/pro-半抗原雙氯苯雙胍己烷、乙二胺和二乙烯二胺準確識別[14]。

Fujita 等[15]通過對氨基酸衍生物進行優(yōu)化，使用 N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-cysteine（NAC）和 α-N-(2-(1- naphthyl)acetyl)-L-lysine（NAL）取代 DPRA 中的半胱氨酸多肽或賴氨酸多肽，開發(fā)出了氨基酸衍生物反應(yīng)法（amino acid derivative reactivity assay，ADRA）。研究人員應(yīng)用 ADRA 對 88 個待測物進行檢測，準確度達 88%，與 DPRA 類似。后續(xù)研究人員又對氨基酸衍生物溶液的 pH、待測物/氨基酸衍生物比率等進行了優(yōu)化。ADRA 靈敏度高，因而待測物的濃度可由 100 mmol/L 降低至 1 mmol/L，這使得易于制備一些溶解性差的待測物。此外 NAC/NAL 因其對待測物濃度要求較低，待測物不太可能出現(xiàn)沉淀和產(chǎn)生渾濁，預(yù)計定量更加準確[15]。ADRA 方法優(yōu)化后，準確度高達 90%（82 個待測物）[15]。

4 與其他替代實驗方法的聯(lián)合運用

單一的非動物替代試驗不足以完全覆蓋皮膚致敏有害結(jié)局通路，也不能完全取代動物試驗，因而越來越多研究傾向于聯(lián)合各替代方法以彌補各自的局限，并爭取覆蓋盡可能多的皮膚致敏有害結(jié)局通路事件。最少兩個關(guān)鍵事件的組合，如蛋白結(jié)合和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）激活，使其在皮膚致敏中相關(guān)性更強，增強互補，因而提升了預(yù)測能力。

表 1 整合測試策略致敏性預(yù)測

注：*LLNA 致敏物（102），LLNA 非致敏物（37）；#LLNA 致敏物（76），LLNA 非致敏物（25）；&LLNA 致敏物（77），LLNA 非致敏物（26）。

表 2 整合測試策略致敏效力預(yù)測

注：*LLNA：極強 + 強致敏（29），中等 + 弱致敏（73），未分級（37）；#LLNA：極強 + 強致敏（24），中等 + 弱致敏（52），未分級（25）；&LLNA：極強 + 強致敏（23），中等 + 弱致敏（54），未分級（26）。

4.1 集成檢測策略

研究人員通過組合 139 個化學(xué)品的物理化學(xué)信息、LLNA、h-CLAT（human cell line activation test）、DPRA、DEREK 數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個具有綜合性、多樣性、高質(zhì)量特點的數(shù)據(jù)集[16]?；谏鲜鰯?shù)據(jù)集，研究人員精煉了集成檢測策略（integrated testing strategy，ITS）和次序檢測策略（sequential testing strategy，STS）。如表 1 和表 2 所示，就預(yù)測而言集成檢測策略與 LLNA 相比，危害識別準確高達 84%，效力分類準確度達 71%。與之類似，STS 準確度分別達到 81% 和 69%[16]。當(dāng)排除 low Kow > 3.5 的待測物后，ITS 和 STS 的預(yù)測表現(xiàn)進一步提升。ITS 和 STS 與單用 h-CLAT 或 DPRA 相比，準確度更高，分別為 84% 和 81%[16]。Jaworska 等[19]基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建了 ITS-3，并拓展了應(yīng)用范圍。ITS-3 可用于危害性識別、GHS 分級、定量風(fēng)險評估等。該方法相較于 ITS-2 提高了準確度、精密度，優(yōu)化了預(yù)測性。

4.2 分層測試策略

研究人員將 QSARs（quantitative structure-activity relationships）、DPRA、KeratinoSens、Gene signature、h-CLAT等按圖 1 所示分成 3 個層次，并按照圖示規(guī)則進行評估[20]。該策略有效彌補了各單一方法的不確定性，并正確地區(qū)分出所測 41 個待測物。然而該法可能無法識別出其他未參與測試的 pro-半抗原。因為該策略僅第二層的 HaCaT 細胞有一些代謝能力，而其他層面的代謝能力不足甚至缺失[20]。Pro-半抗原僅能在第二層被識別，因而可能無法正確區(qū)分這類物質(zhì)的致敏性。未來可將 DPRA 更換成具有代謝能力的 PPRA 或在 KeratinoSens 中加入 S9 代謝部分以彌補該缺陷。此外，分層測試策略的另一局限是無法評估化學(xué)品的致敏效力。效力可通過高級統(tǒng)計方法，如定量機械模型、貝葉斯統(tǒng)計法進行評估。分層測試策略一方面可能減少假陰性結(jié)果，另一方面卻可能提升假陽性結(jié)果，此外其靈敏度較高，特異性較低。

Kimura 等[18]將 IL-8 Luc 法與 DPRA 組合成分層預(yù)測法，并對 103 個待測物進行了評估。IL-8 Luc 法靈敏度高、適合于強致敏劑的檢測，故作為第一層次。而對于 IL-8 Luc 檢測不出的弱和中等致敏劑則采用 DPRA 評估。如表 1 所示，該層次預(yù)測法靈敏度高達 96.1%（74/77），準確度高達 87.4%（90/103）[18]。更重要的是 IL-8 Luc 和 DPRA 層次預(yù)測法可區(qū)分出 54 個 LLNA 中定義為弱或中等致敏劑中的 51 個（表 2）。在另一項研究中，研究人員將 h-CLAT 和 DPRA 組合成分層系統(tǒng)，該預(yù)測系統(tǒng)靈敏度高達 96%，準確度達 86%（表 1）[17]。

4.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析是一種非線性數(shù)據(jù)統(tǒng)計建模工具，用于建模輸入和輸出的復(fù)雜關(guān)系，并且具有類似神經(jīng)的學(xué)習(xí)能力。該模型運用多個由體外致敏實驗而來的參數(shù)進行組合，旨在進一步提升預(yù)測性能。參數(shù)涵蓋 h-CLAT、DPRA、SH test 以及抗氧化反應(yīng)元件測定法（antioxidant response element assay）等[21]。研究表明，在兩兩組合中，應(yīng)用 h-CLAT/DPRA 的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型比 DPRA/抗氧化反應(yīng)元件測定法或 SH test/抗氧化反應(yīng)元件測定法，LLNA 閾值相關(guān)性更好[21]。此外模型參數(shù)的增加有助于減少假陰性結(jié)果。三參數(shù)模型相較兩參數(shù)模型，值更好，RMS error 更低[21]?；瘖y品成分復(fù)雜多樣，其組分物理性質(zhì)不盡相同，如水溶性、脂溶性、硅溶性、分子量、多聚物、植物提取物等。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型有望發(fā)展成一個非動物皮膚致敏性評價系統(tǒng)以覆蓋盡可能多的化妝品。

4.4 基于分數(shù)的預(yù)測系統(tǒng)

研究人員同樣基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)集成測試策略將已見報道的 h-CLAT、DPRA 和 DEREK 數(shù)據(jù)整合成一個含 101 個化學(xué)品的數(shù)據(jù)集，并將各類試驗數(shù)據(jù)折算成 0 ~ 2 分后進行分數(shù)加和[17]。如表 1 和表 2 所示，該方法與 LLNA 相比，對化學(xué)品致敏性和效力的預(yù)測準確度分別達到 85% 和 71%[17]。Kimura 等[18]基于致敏性分類，將 IL-8 Luc 數(shù)據(jù)和 DPRA 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成 0 ~ 2 分，整合了一套基于分數(shù)的預(yù)測系統(tǒng)。該系統(tǒng)識別出了 23 個 LLNA 法中強致敏劑中的 14 個并劃分為強致敏劑，另外也識別出了 54 個 LLNA 法中弱或中等致敏劑中的 38 個并歸類為弱致敏劑。該系統(tǒng)準確度達 70.9%（表 2）。

2/3 預(yù)測模型：Urbisch 等[22]將 DPRA、KeratinoSens 和 h-CLAT 的各單項試驗結(jié)果整合成 2/3 預(yù)測模型：即任何兩個試驗結(jié)果相同，則模型整體評價與該結(jié)果相同。以該預(yù)測模型對 213 種化學(xué)品進行評估，與人試驗數(shù)據(jù)相比準確度高達 90%，與動物 LLNA 數(shù)據(jù)相比，準確度達 79%。

圖 1 分層測試策略

整合不同試驗數(shù)據(jù)可有效克服單一試驗的不足[23]。Strickland 等[24]通過對 120 個化學(xué)品 LLNA、DPRA、h-CLAT 和 KeratinoSens 數(shù)據(jù)的編制，并將可能影響物質(zhì)致敏的物理化學(xué)因素考慮在內(nèi)，構(gòu)建了一系列預(yù)測模型。其中 7 個模型準確度較高，并將 3 個 pre-半抗原和 6 個 pre/pro-半抗原準確識別為致敏物。此外，4 個表現(xiàn)最優(yōu)的模型在模型訓(xùn)練和測試中均準確識別出 16 個 pro-半抗原。

5 小結(jié)

直接肽反應(yīng)試驗具有高準確度、高靈敏度和操作相對簡便等優(yōu)點，經(jīng)過研究者們不斷優(yōu)化和發(fā)展，已具備了一定的生物轉(zhuǎn)化能力，可用于對 pre/pro-半抗原進行致敏性評價，并降低了對待測物的濃度要求，從而進一步拓展了其應(yīng)用范圍。然而各類致敏試驗替代方法均有其內(nèi)在局限，目前均不能完全替代動物試驗，而各類替代方法的整合成為趨勢。直接肽反應(yīng)試驗在各類整合替代試驗方案中，不可或缺。我們相信隨著皮膚致敏體外試驗方法的不斷完善和計算機致敏評估模型的持續(xù)優(yōu)化和升級，皮膚致敏試驗替代方法的應(yīng)用將越來越廣。

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中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金課題（2017C6）

劉婷，Email：lutyliu@126.com

2018-09-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.014