李 莎 司 堯 馮寶峰 張沂洲 崔慧先△

(河北醫(yī)科大學(xué),1 人體解剖學(xué)教研室,2 神經(jīng)科學(xué)研究中心,石家莊 0050017)

與細(xì)胞系自身缺陷較多以及不能很好地模擬體內(nèi)神經(jīng)元的功能和狀態(tài)相比,原代神經(jīng)元的體外培養(yǎng)在神經(jīng)系統(tǒng)尤其是神經(jīng)退行性疾病的研究中發(fā)揮著重要的作用[1]。海馬是與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的重要腦區(qū),其突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。樹(shù)突棘是腦內(nèi)興奮性連接的主要位點(diǎn),在突觸形成及其功能上發(fā)揮著重要的作用,樹(shù)突棘在數(shù)量和形態(tài)方面的改變會(huì)直接影響突觸的功能,進(jìn)而影響腦功能的改變,所以觀察培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘的形態(tài)學(xué)變化是研究神經(jīng)退行性疾病突觸可塑性機(jī)制的重要研究手段。活細(xì)胞成像能實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài),更直觀地反映細(xì)胞變化,隨著該研究手段越來(lái)越受關(guān)注,原代神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染就成為研究手段中一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌梢赃x擇不同的轉(zhuǎn)染方法,由于原代神經(jīng)元屬于高度分化的細(xì)胞,難于轉(zhuǎn)染,又基于進(jìn)行樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的研究目的,本研究選擇用Lipofectamine 2000和慢病毒2種轉(zhuǎn)染方法對(duì)原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,觀察原代海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效果及樹(shù)突棘的形態(tài)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

孕18d SD大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen;GFP質(zhì)粒購(gòu)自Addgene;含有GFP的慢病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因;DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基和OptiMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen;胎牛血清、B27添加劑、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青鏈霉素購(gòu)自Gibco;Accutase消化酶購(gòu)自Millipore;DNA酶購(gòu)自TaKaRa;細(xì)胞黏附液購(gòu)自普利萊。

1.2 大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)

孕18d SD大鼠用乙醚經(jīng)鼻腔吸入麻醉,無(wú)菌操作快速取出胎鼠腦組織于預(yù)冷的D-hanks緩沖液中,剝離兩側(cè)海馬,組織剪剪碎后,用含有0.1% DNase的Accutase酶消化15min,消化期間每隔5min輕晃一下,消化結(jié)束后靜置去上清,用含B27的Neurobasal培養(yǎng)基吹打重懸,靜置取上清液,100目過(guò)濾,離心去上清,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,200目過(guò)濾,種于共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿上,種皿密度為1×105。3h后換為Neurobasal培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每3d換液1次。

1.3 大鼠原代海馬神經(jīng)元GFP轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)至第8天進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1天將培養(yǎng)基換成不含青鏈霉素的Neurobasal,加入125μl的OptiMEM培養(yǎng)基,再分別加入0.25μg的pEGFP質(zhì)粒和0.75μl的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(此用量為單個(gè)皿的用量),超凈臺(tái)內(nèi)室溫孵育5min,然后將2管液體混勻,室溫靜置15min,使質(zhì)粒和脂質(zhì)體充分結(jié)合。將含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的混合液緩慢滴加到培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),3h后換為含有青鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。慢病毒轉(zhuǎn)染：經(jīng)過(guò)前期感染復(fù)數(shù)(MOI)的摸索,確定MOI為30。用1ml新鮮的培養(yǎng)基混入3μl慢病毒,輕輕混勻,將原培養(yǎng)基換成含有慢病毒的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染2h后補(bǔ)加1ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),第2天吸出含病毒的培養(yǎng)基換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)高峰時(shí)(轉(zhuǎn)染72h)表達(dá)GFP的神經(jīng)元,比較2種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率,并分別在轉(zhuǎn)染前后24h及轉(zhuǎn)染后1周用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色,檢測(cè)神經(jīng)元存活率。動(dòng)態(tài)、連續(xù)地觀察比較轉(zhuǎn)染1周后神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況及熒光表達(dá)情況,確定后續(xù)研究采用的轉(zhuǎn)染方法。

1.4 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP觀察海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘生長(zhǎng)發(fā)育情況

大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第8天用Lipofectamine 2000進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染,然后分別在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)至10、15、20d和25d時(shí)用共聚焦顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.5 不同時(shí)間轉(zhuǎn)染對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的影響

分別在大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至8、12、16d用Lipofectamine 2000進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)至20d時(shí)用共聚焦顯微鏡觀察不同時(shí)間轉(zhuǎn)染對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Lipofectamine 2000和慢病毒轉(zhuǎn)染GFP

對(duì)大鼠原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染,兩種轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)高峰時(shí),全細(xì)胞表達(dá)GFP,活性較好的神經(jīng)元胞體豐滿,呈錐體形或多邊形,神經(jīng)元突起顯現(xiàn)清晰,樹(shù)突棘還未成熟,多是細(xì)長(zhǎng)的絲狀偽足。2種轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率相比,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效率為5.21%,低于慢病毒轉(zhuǎn)染效率82.53%(P<0.05);但就轉(zhuǎn)染前后神經(jīng)元存活率而言,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染后24h存活率為93.78%,高于慢病毒轉(zhuǎn)染存活率83.37%(P<0.05)。轉(zhuǎn)染1周后,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染存活率為91.59%,高于慢病毒轉(zhuǎn)染存活率72.92%(P<0.05)。后期動(dòng)態(tài)、連續(xù)的觀察結(jié)果顯示,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染成功的神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好,而慢病毒轉(zhuǎn)染成功的神經(jīng)元出現(xiàn)了較明顯胞體邊緣不圓潤(rùn),胞內(nèi)可見(jiàn)部分顆粒,突起雜亂不清晰,甚至有串珠樣改變等現(xiàn)象,熒光表達(dá)也很微弱,較難清楚地顯示樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)。對(duì)于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)方面的研究而言,慢病毒轉(zhuǎn)染難以用于后期樹(shù)突棘的觀察,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染顯得更為優(yōu)越(表1,圖1,見(jiàn)封底)。

2.2 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP觀察海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘生長(zhǎng)發(fā)育情況

大鼠原代海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)至第10天時(shí),突起伸長(zhǎng)明顯,絲狀偽足運(yùn)動(dòng)活躍并開(kāi)始變短、變寬,熒光表達(dá)良好。第15天時(shí),樹(shù)突分支增多,交織呈網(wǎng)狀,絲狀偽足明顯減少,發(fā)育中的樹(shù)突棘呈現(xiàn)出細(xì)桿狀和粗棒狀,熒光表達(dá)良好。第20天時(shí),樹(shù)突棘發(fā)育比較成熟,形態(tài)多樣,包括細(xì)桿狀、短棒狀或蘑菇狀等,熒光表達(dá)減弱。第25天時(shí),樹(shù)突數(shù)目和分支減少,粗細(xì)不等或呈串珠樣改變,樹(shù)突棘形態(tài)雜亂,短粗狀或蘑菇狀的樹(shù)突棘大幅度減少,細(xì)長(zhǎng)的樹(shù)突棘增多,熒光表達(dá)明顯降低(圖2，見(jiàn)封底)。

2.3 不同時(shí)間轉(zhuǎn)染對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察的影響

就轉(zhuǎn)染效率而言,第8天和第12天轉(zhuǎn)染效率尚可,且兩者的轉(zhuǎn)染效率沒(méi)有明顯的差別,但第16天的轉(zhuǎn)染效率非常低,僅少數(shù)神經(jīng)元被轉(zhuǎn)染。從轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)情況來(lái)評(píng)判,第8天轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元培養(yǎng)至第20天時(shí)熒光表達(dá)量很低,樹(shù)突棘的形態(tài)不清晰,不適合轉(zhuǎn)染后長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)進(jìn)行樹(shù)突棘觀察;第12天轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元培養(yǎng)至第20天時(shí)熒光表達(dá)良好,樹(shù)突棘形態(tài)清晰可見(jiàn),適合進(jìn)行樹(shù)突棘的活細(xì)胞成像(圖3，見(jiàn)封底)。

3 討論

觀察樹(shù)突棘的變化對(duì)闡明神經(jīng)元的發(fā)育以及研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病突觸可塑性機(jī)制具有重要意義[2]。傳統(tǒng)的通過(guò)固定細(xì)胞后染色研究樹(shù)突棘形態(tài)的方法,雖有廣泛的應(yīng)用,但這些方法不能體現(xiàn)樹(shù)突棘的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。隨著研究的深入,轉(zhuǎn)染GFP表達(dá)的神經(jīng)元活細(xì)胞成像技術(shù)因可實(shí)現(xiàn)對(duì)樹(shù)突棘的生長(zhǎng)發(fā)育以及使用藥物或其他干預(yù)手段對(duì)樹(shù)突棘影響的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察,目前已成為樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)機(jī)制研究的的有效方法[3]。常用的轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染等[4]。對(duì)于細(xì)胞系而言,這些方法均可獲得較理想的轉(zhuǎn)染效果。但對(duì)于不能進(jìn)行細(xì)胞分裂、高度分化的原代培養(yǎng)神經(jīng)元來(lái)說(shuō),外源基因難以進(jìn)入,較難轉(zhuǎn)染。在常用的轉(zhuǎn)染方法中,轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性等為需要考慮的重要問(wèn)題。磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染成本低、操作簡(jiǎn)單,但轉(zhuǎn)染效率一般在1%～5%之間,且結(jié)果常不穩(wěn)定[5];電穿孔轉(zhuǎn)染為目前最自動(dòng)化和較高效的轉(zhuǎn)染方法,但細(xì)胞存活率較低,且需要電轉(zhuǎn)儀等儀器設(shè)備[6];脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)染方法之一,傳統(tǒng)的Lipofectamine 2000試劑較此基礎(chǔ)上的換代產(chǎn)品來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)染效率雖無(wú)優(yōu)勢(shì),但轉(zhuǎn)染穩(wěn)定,神經(jīng)元存活率高[7-8];病毒轉(zhuǎn)染是體外培養(yǎng)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率最高的轉(zhuǎn)染方法,應(yīng)用廣泛[9]。

基于對(duì)樹(shù)突棘進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究的目的,本研究使用Lipofectamine 2000和慢病毒2種轉(zhuǎn)染方法對(duì)原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,在轉(zhuǎn)染效率、存活率以及神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況、熒光表達(dá)情況等方面進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染方法雖然轉(zhuǎn)染效率較慢病毒轉(zhuǎn)染低,但神經(jīng)元存活率高。同時(shí),Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染對(duì)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元無(wú)明顯毒性,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。慢病毒轉(zhuǎn)染成功的神經(jīng)元還未等樹(shù)突棘發(fā)育成熟,便出現(xiàn)了較明顯胞體邊緣不圓潤(rùn),胞內(nèi)顆粒、突起雜亂不清晰,甚至有串珠樣改變等現(xiàn)象,熒光表達(dá)也很微弱,較難清楚地顯示樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)。對(duì)于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)以單個(gè)神經(jīng)元為觀察對(duì)象的樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)方面的研究而言,慢病毒轉(zhuǎn)染難以用于后期樹(shù)突棘的觀察研究,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染顯得更為優(yōu)越,能夠較好地滿足研究需要。當(dāng)然,對(duì)于使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染這項(xiàng)技術(shù)受多方面因素的影響,比如細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例以及轉(zhuǎn)染時(shí)間的長(zhǎng)短等,這些都直接影響轉(zhuǎn)染的效果。

神經(jīng)元發(fā)育早期,樹(shù)突干上有許多未成熟的絲足狀突起,進(jìn)行著伸縮、擺動(dòng)、分杈和扭曲等活躍的動(dòng)態(tài)活動(dòng)。隨著神經(jīng)元的發(fā)育,絲足狀突起發(fā)育為形態(tài)多樣的成熟的樹(shù)突棘。本研究?jī)?yōu)化了Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染原代海馬神經(jīng)元觀察成熟樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)的方法。通過(guò)這一方法,對(duì)培養(yǎng)12d的原代海馬轉(zhuǎn)染后至20d時(shí),運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡搭配活細(xì)胞工作站進(jìn)行神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察,可清晰顯示表達(dá)GFP海馬神經(jīng)元的形態(tài),結(jié)合活細(xì)胞成像即可達(dá)到高對(duì)比度、高清晰度和高分辨率地動(dòng)態(tài)觀察樹(shù)突棘形態(tài)變化的目的,為更深入地研究樹(shù)突棘可塑性提供了良好的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

圖1 Lipofectamine 2000和慢病毒轉(zhuǎn)染GFP結(jié)果,第8天轉(zhuǎn)染,第11天觀察,標(biāo)尺=50μm。A,B：Lipofectamine 2000組;C,D：Lentivirus組.

圖2 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP觀察海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘生長(zhǎng)發(fā)育情況,第8天轉(zhuǎn)染,第10、15、20和25天觀察,標(biāo)尺=50μm。A：第10天;B：第15天;C：第20天;D：第25天.

圖3 Lipofectamine 2000不同時(shí)間轉(zhuǎn)染GFP對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)的影響,第8、12、16天轉(zhuǎn)染,第20天觀察,標(biāo)尺=50μm。A,B：第8天;C,D：第12天;E,F：第16天;B,D,F轉(zhuǎn)染區(qū)域放大；G：Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染培養(yǎng)12天原代海馬神經(jīng)元,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至20天時(shí)進(jìn)行神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)觀察.

Fig 1 The transfection result of Lipofectamine 2000 and Lentivirus with GFP,transfected on day 8,observed on day 11,bar=50μm.A,B：Lipofectamine 2000 group;C,D：Lentivirus group.

Fig 2 The result of the growth and development of dendritic spines using the transfection of Lipofectamine 2000,transfected on day 8,observed on day 10,15,20 and 25,bar=50μm.A：day 10;B：day 15;C：day 20;D：day 25.

Fig 3 The effect on the morphology of hippocampal neuron dendritic spines when transfected on different times using the transfection of Lipofectamine 2000,transfected on day 8,12 and 16,observed on day 20,bar=50μm.A,B：8d;C,D：12d;E,F：16d;Magnification of transfected area was shown in the inset of Figure B,D,F.G：Lipofectamine 2000 transfected hippocampal neuron on day 12 and then observed the morphology of dendritic spines on day 20.