土茯苓叢生芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化

梁崇 廖莉莉

摘要 為優(yōu)化土茯苓的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，提高土茯苓組織培養(yǎng)效率，促進(jìn)其資源保護(hù)和合理開發(fā)利用。以土茯苓帶腋芽莖段為外植體，采用組織培養(yǎng)方法，研究不同外源激素配比對(duì)莖段叢生芽誘導(dǎo)分化和不定芽增殖的影響。結(jié)果表明：土茯苓莖段叢生芽誘導(dǎo)分化最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L，芽誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)6.35，不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L，其增殖數(shù)高達(dá)8.8，且芽生長良好。

關(guān)鍵詞 土茯苓;叢生芽;誘導(dǎo)分化;增殖

中圖分類號(hào) S567.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

土茯苓（Smilax glabra Roxb.）為百合科菝葜屬植物，為傳統(tǒng)清熱解毒常用中藥，具有調(diào)中止瀉、健脾胃、強(qiáng)筋骨、除濕、利關(guān)節(jié)等功效[1，2]?，F(xiàn)代分析土茯苓含生物堿、揮發(fā)油、已糖類、鞣酸、植物甾醇、琥珀酸、胡蘿b苷、落新婦苷、白藜蘆醇、異黃杞苷、異落新婦苷、抽皮素等多種成分[3，4]。臨床和藥理治療試驗(yàn)表明，土茯苓具有利尿、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗動(dòng)脈硬化、抑菌抗炎及增強(qiáng)肌體免疫作用[5-10]。另外，土茯苓含有的甾體皂苷元為我國制作口服避孕藥的主要半合成原料[11]。廣西是土茯苓的道地產(chǎn)區(qū)，由于土茯苓功用逐年開發(fā)，其用量逐年增長，而土茯苓野生資源長年被無序利用及產(chǎn)地發(fā)展經(jīng)濟(jì)林對(duì)其生境的破壞，野生資源逐年消殆，市場貨源日漸緊缺[13]。因此，開展土茯苓的人工栽培以滿足市場需求勢在必行。

土茯苓的人工栽培需解決種苗問題，然而土獲等扦插及種子繁殖均不理想;在組培方面，只有少數(shù)學(xué)者作了一些研究[12，13]。但多采用土茯苓根莖做培養(yǎng)材料，一定程度上損耗了具有高藥用價(jià)值的資源。本試驗(yàn)選擇取材方便且不具有較大藥用價(jià)值的土茯苓帶腋芽莖段進(jìn)行叢芽的誘導(dǎo)與芽增殖培養(yǎng)優(yōu)化技術(shù)研究，以期變廢為寶，在原有組織培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)，為土茯苓大規(guī)?？焖俑咝Х敝程峁┘夹g(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用引種的土茯苓植株，取當(dāng)年生嫩莖為外植體

1.2 方法

1.2.1 無菌材料處理

將土茯苓嫩莖置洗衣粉水中浸泡5min，用自來水細(xì)流水沖洗8min;在超凈工作臺(tái)上用0.2%HgCl₂浸泡消毒8min，然后用無菌水浸洗3～4次，每次1min;將帶有嫩芽的外植體切成長約1.5cm[14]。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）、激動(dòng)素（KT）、茶乙酸（NAA）。設(shè)置13種培養(yǎng)基，見表1。每種培養(yǎng)基20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，在培養(yǎng)條件含蔗糖2.5%，瓊脂0.5%，溫度（25±2）℃，光照時(shí)間10h/d，光照強(qiáng)度1500～20001x下培養(yǎng)[14]。培養(yǎng)期間定時(shí)觀察叢生芽生長情況，培養(yǎng)粼]d后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)。

1.2.3 叢生芽的繼代增殖

將誘導(dǎo)獲得的叢生芽分成單芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。設(shè)置4種培養(yǎng)基，見表2。培養(yǎng)條件與

1.2.2 相同，培養(yǎng)40d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)胞分裂素及其濃度對(duì)叢生芽誘導(dǎo)分化的影響

細(xì)胞分裂素是植物組織培養(yǎng)中促進(jìn)組織分化和生長的物質(zhì)，其不同種類及濃度對(duì)組織的分化和生長有不同程度的影響。在土茯苓莖段叢芽分化培養(yǎng)中，6-BA的作用效果比KT顯著。6-BA在0.6～1.8，芽的誘導(dǎo)倍數(shù)隨著濃度的升高而提高。從叢生芽數(shù)和芽的長勢來看，不同濃度的6-BA對(duì)土茯苓叢生芽的誘導(dǎo)有很大影響。隨著6-BA濃度的增加，叢生芽誘導(dǎo)數(shù)也不斷提高，當(dāng)6-BA濃度達(dá)1.8mg幾時(shí)誘導(dǎo)叢芽數(shù)最多，誘導(dǎo)倍數(shù)為（3.35±0.6），比對(duì)照CK（0.4±0.48）提高了8倍多，芽較粗壯。當(dāng)6-BA濃度大于1.8mg/L，叢生芽減少，嚴(yán)重玻璃化。在8個(gè)處理中，6-BA1.8mg/L芽誘導(dǎo)倍數(shù)最高，與其它各處理間存在極顯著差異，其次為6-BA1.2mg/L。因此，土茯苓叢生芽分化誘導(dǎo)以細(xì)胞分裂素6-BA，濃度1.2～1.8mg/L為宜。結(jié)果見表3。

2.2 不同外源激素及濃度配比對(duì)叢生芽誘導(dǎo)分化的影響

在不同外源激素及濃度配比的培養(yǎng)基中土獲苓莖段都有不同程度的叢生芽分化。從分化叢生芽數(shù)和芽的長勢來看，以12號(hào)培養(yǎng)基最佳，平均芽誘導(dǎo)倍數(shù)為（6.35±1.01），與其它培養(yǎng)基存在顯著性差異。相同的6-BA濃度下，添加低濃度NAA對(duì)芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，同時(shí)減輕叢芽玻璃化;添加低濃度的KT可較大幅度提高叢芽的誘導(dǎo)倍數(shù)。結(jié)果見表4。

2.3 叢生芽的繼代增殖

叢生芽轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中，在4種不同外源激素配比的繼代培養(yǎng)基中均有不同程度的叢生芽增殖，且以16號(hào)培養(yǎng)基增殖最好，平均芽增殖倍數(shù)達(dá)（8.8±1.02），生長健壯，與其它增殖培養(yǎng)基存在顯著性差異;其次是巧號(hào)培養(yǎng)基。結(jié)果見表5、圖1。

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)源激素的調(diào)控是叢生芽成功誘導(dǎo)的重要因素。在植物組織培養(yǎng)過程中，外源生長物質(zhì)對(duì)植物形態(tài)的分化作用實(shí)際上是重新調(diào)整了內(nèi)源生長素和細(xì)胞分裂素的平衡，外植體組織中內(nèi)源激素水平的不同引起培養(yǎng)基中最適外源生長物質(zhì)濃度的變化[15]。植物的器官分化需要較嚴(yán)格的細(xì)胞分裂素和生長素平衡。因此，不同植物的組織培養(yǎng)就有不同生長物質(zhì)種類及濃度的需要。在土茯苓帶腋芽莖段叢生芽誘導(dǎo)和不定芽增殖培養(yǎng)試驗(yàn)中，適當(dāng)?shù)姆至阉睾蜕L素濃度對(duì)土茯苓叢生芽的分化有很大的影響。配比過低不利于叢生芽的誘導(dǎo)萌發(fā)，配比過高，則會(huì)導(dǎo)致叢生芽產(chǎn)生玻璃化。且2種細(xì)胞分裂素與生長素配比組合比單一細(xì)胞分裂素及單一細(xì)胞分裂素、生長素配比較好，這可能是因?yàn)樵谕淋蜍唠x體培養(yǎng)中，6-BA雖是主要、需求量較大的外源細(xì)胞分裂素，但KT作為一種非天然的細(xì)胞分裂素被植物的葉、莖、緩慢吸收，其促進(jìn)細(xì)胞分化、分裂、生長，誘導(dǎo)愈傷組織長芽的機(jī)理功能可能是6-BA所不具備的，少量KT的添加，可以使植物外植體達(dá)到一個(gè)新的完美平衡，從而促使叢生芽大幅度提高，這與廖莉莉[14]等研究的KT對(duì)金櫻子芽誘導(dǎo)與增殖影響結(jié)果相似，添加KT比前人研究的土茯苓芽增殖及同屬菝葜的嫩莖芽誘導(dǎo)增殖增加1倍以上[13，16]，且芽生長健壯。因此，土茯苓帶腋芽莖段叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中以6-BA1.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L組合最好，誘導(dǎo)倍數(shù)可達(dá)6倍以上。不定芽增殖培養(yǎng)中，以6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L組合最好，增殖倍數(shù)可高達(dá)8.8，且芽長勢良好。

參考文獻(xiàn)

[1]鄧?yán)碛?土茯苓的新用途[J].藥膳食療，2004（s）：16.

[2]田君，池汝安，張?jiān)椒?，?從土茯苓浸取液萃取黃酮的研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（5）：340-342.

[3]沈爾安除濕毒抗癌魔的土茯苓[J].東方藥膳2006（7）-21.

[4]隋欣，暴悅梅大孔樹脂分離土茯苓黃酮的研究[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（7）：48-51.

[5]張白嘉，劉亞歐，劉榴，等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用研究[J].中藥藥理與臨床雜志，2004，20（1）：11-12.

[6]邱光清，許連好，林潔娜，等.土獲冬總皂甙的抗腫瘤作用研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17（5）;14-15

[7]李強(qiáng).土茯苓現(xiàn)代研究概述[J].中國藥業(yè)，2008（14）：76-78.

[8]王志強(qiáng)，邱世翠，宋海英，等.土茯苓體外抑茵作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（11）：2203-2204.

[9]殷網(wǎng)虎，袁武軍，曹美琳.土茯苓配方顆粒對(duì)臨床常見致病菌的抗菌研究[J].中國中醫(yī)急癥，2011，20（12）：1957-1958.

[10]徐強(qiáng).土茯苓對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，1993，9（1）：39.

[11]黃少偉.土茯苓總黃酮與多糖的提取與分離[D].武漢：武漢工程大學(xué)，2008.

[12]曾宋君，昊坤林，陳國華，等.土茯苓離體快繁研究[J].中藥材，2005，28（1）：1-2.

[13]董青松，閆志剛，白隆華，等.土茯苓組織培養(yǎng)研究[J].中藥材，2014，37（1）：5-9.

[14]廖莉莉，藍(lán)祖栽，凌征柱金櫻子組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24（6）：22-24.

[15]肖尊安.植物生物技術(shù)（M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：16-17，55-56.

[16]李青.菝葜組織培養(yǎng)及植株再生體系的建立[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：49.