李俊昊 余天柱 高珊珊 劉霄宇 浦 寧 李長(zhǎng)煜 陳 頤 紀(jì) 元 樓文暉 王小林

(1上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科,3普外科,4病理科 上海 200032)

胰腺導(dǎo)管腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,全世界每年有26萬(wàn)人死于胰腺癌[1],并且發(fā)病率逐年上升[2]。胰腺癌起病隱匿,通常確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[3],加之術(shù)后復(fù)發(fā)率高、放化療效果不佳[4],故胰腺癌患者預(yù)后極差。因此,探索新的胰腺癌治療方式和預(yù)后因子對(duì)提高胰腺癌的診治水平和改善患者生存期尤為重要。

程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)的配體,主要表達(dá)于免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。PD-1是活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞細(xì)胞膜上的跨膜受體[5]。正常組織中,機(jī)體可通過(guò)PD-L1和PD1調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。而在癌癥患者體內(nèi),腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與PD1+CD8+T細(xì)胞結(jié)合后,活化的T細(xì)胞失去免疫功能。癌細(xì)胞能夠躲避免疫系統(tǒng)的攻擊,從而發(fā)生免疫逃逸[6]。因此,目前普遍認(rèn)為PD-L1表達(dá)陽(yáng)性是腫瘤患者預(yù)后不良的標(biāo)志。最近有研究報(bào)道,PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤組織中存在大量腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,表現(xiàn)出良好的預(yù)后[7]。這似乎提示我們,PD-L1陽(yáng)性并非只代表腫瘤發(fā)生免疫逃逸,同時(shí)也是腫瘤組織內(nèi)存在大量腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的標(biāo)志。除此之外,臨床上已經(jīng)使用PD1/PDL1抑制劑治療晚期黑色素瘤[8-9]、非小細(xì)胞肺癌[10-11]和腎癌[12]等腫瘤,能有效延長(zhǎng)腫瘤患者總體生存期。

因此,PD-L1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療密切相關(guān)。作為一種新型可預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的因子,PD-L1在判斷胰腺癌預(yù)后方面的研究相對(duì)較少。本研究旨在探討PD-L1表達(dá)與胰腺癌臨床特征之間的關(guān)系,以及判斷胰腺癌預(yù)后的價(jià)值。

資 料 和 方 法

研究對(duì)象收集2015年7月至2017年8月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胰腺外科68例行胰腺癌根治術(shù)并進(jìn)行PD-L1病理染色的患者資料,所有患者術(shù)后病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌。將入組患者按照PD-L1染色結(jié)果分為PD-L1陽(yáng)性組和PD-L1陰性組。入組標(biāo)準(zhǔn):(1)首次行腫瘤根治性切除術(shù);(2)根據(jù)手術(shù)病理確診為胰腺導(dǎo)管腺癌;(3)腫瘤組織行PD-L1染色;(4)隨訪和臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并或既往有其他腫瘤病史;(2)胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、腺鱗癌、轉(zhuǎn)移癌等非胰腺導(dǎo)管腺癌。通過(guò)電話、短信、郵件、信件對(duì)患者生存時(shí)間進(jìn)行隨訪,隨訪截止到2017年10月24日,結(jié)局事件為患者死亡?？偵嫫?overall survival,OS)定義為從行胰腺癌手術(shù)開(kāi)始到隨訪終止日期或患者死亡的時(shí)間。

免疫組化染色采用免疫組織化學(xué)SP142二步法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)腫瘤組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片,厚度4 μm。胰腺癌組織經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇水化后,室溫3%過(guò)氧化氫溶液孵育15 min,PBS溶液漂洗3次,每次5 min。后將切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中99 ℃水浴加熱,抗原修復(fù)20 min,溫度降至室溫后PBS溶液漂洗,方法同上。5%BSA室溫封閉30 min,兔抗人PD-L1多克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,PBS漂洗,方法同上,SP142二抗室溫孵育20 min,PBS漂洗,方法同上。DAB顯色劑染色8 min后蒸餾水沖洗,終止顯色。蘇木精復(fù)染50 s,自來(lái)水沖洗返藍(lán),梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。

結(jié)果判定免疫組化切片均由2名資深病理醫(yī)師雙盲獨(dú)立觀察評(píng)估,請(qǐng)第3位病理醫(yī)師評(píng)估,以兩個(gè)相同結(jié)果為準(zhǔn)。PD-L1以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽(yáng)性顯色。PD-L1表達(dá)采用半定量積分法,結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比來(lái)評(píng)定陽(yáng)性表達(dá)病例。低倍鏡下觀察5個(gè)隨機(jī)高倍視野(×400),染色強(qiáng)度分級(jí)如下:無(wú)著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞密度分級(jí)為:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分,10%～50%為2分,>50%為 3分。通過(guò)乘積法計(jì)算所得結(jié)果≥3分為判定為陽(yáng)性。腫瘤與腫瘤間質(zhì)中任意一項(xiàng)陽(yáng)性則認(rèn)為是PD-L1表達(dá)陽(yáng)性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)68例患者隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)χ2檢驗(yàn)分析68例患者PD-L1表達(dá)和性別、年齡、原發(fā)部位、腫瘤大小、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、切緣狀態(tài)及患糖尿病情況等臨床病理特征之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier方法分析PD-L1生存曲線,并對(duì)曲線進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)。通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮到混雜因素影響,且本研究樣本量不大,單因素分析中P<0.1為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PD-L1表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床基本參數(shù)的關(guān)系納入68例患者,年齡40～79歲,其中男性32例,女性36例,分為PD-L1陽(yáng)性組(51例)和陰性組(17例)。分析兩組患者在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式、手術(shù)切緣以及糖尿病患病情況之間的差異。結(jié)果顯示,PD-L1表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式、手術(shù)切緣以及糖尿病等病理特征無(wú)關(guān)(表1)。

PD-L1表達(dá)在可切除胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后判斷中的價(jià)值68例患者中死亡12例,失訪6例,生存50例。陽(yáng)性組平均生存時(shí)間(19.4±1.4)個(gè)月,陰性組平均生存時(shí)間(11.4±0.8)個(gè)月。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,log-rank檢驗(yàn)評(píng)估PD-L1在預(yù)后判斷OS方面的價(jià)值。陽(yáng)性組生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于陰性組(圖1)。

Cox回歸模型分析影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素采用Kaplan-Meier法對(duì)影響術(shù)后生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析,log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示:PD-L1表達(dá)P=0.013、腫瘤大小P=0.013和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況P=0.077。將上述3個(gè)危險(xiǎn)因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn),PD-L1表達(dá)(HR=0.170,95%CI:0.038～0.761,P=0.020)、腫瘤大小(HR=3.542,95%CI:1.121～11.193,P=0.010)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(HR=5.179,95%CI:1.474～18.195,P=0.019)均為胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素(表2)。

表1 PD-L1表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床基本參數(shù)的關(guān)系Tab 1 The correlation between clinicopathologic characteristics and PD-L1 expression in patients with resectable pancreatic adenocarcinoma (n=68)

圖1 胰腺導(dǎo)管腺癌患者生存曲線分析Fig 1 Survival curve of patients with resectable pancreatic adenocarcinoma

CharacteristicsMultivariate analysisHR (95%CI)PPD-L1 (positive/negative)0.170 (0.038-0.761)0.020Tumor size (>4 cm/≤4 cm)3.542 (1.121-11.193)0.010Lymph node metastasis (yes/no)5.179 (1.474-18.195)0.019

HR:Hazard ratio.

討 論

我們分析了68例可切除胰腺癌患者PD-L1表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系。在68例胰腺癌患者中,PD-L1陽(yáng)性患者51例,占總數(shù)的80.9%。χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果提示,PD-L1表達(dá)情況與臨床病理特征無(wú)關(guān)。采用Kaplan-Meier法繪制PD-L1生存曲線,PD-L1陽(yáng)性組患者的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于PD-L1陰性組患者,log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。采用Kaplan-meier法對(duì)影響術(shù)后生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:PD-L1表達(dá)(P=0.013)、腫瘤大小(P=0.013)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.077)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.10)。將上述3種危險(xiǎn)因素進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn),PD-L1表達(dá)情況、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均為術(shù)后胰腺癌患者OS的獨(dú)立影響因素。因此,PD-L1與可切除胰腺癌預(yù)后密切相關(guān),這提示我們需要對(duì)PD-L1低表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者進(jìn)行密切的臨床觀察與干預(yù)。同時(shí),PD-L1作為一個(gè)輔助判斷預(yù)后的指標(biāo)可為臨床醫(yī)師提供更多信息,有利于提高胰腺導(dǎo)管腺癌患者術(shù)后的整體生存率。由于本研究納入病例數(shù)目不多,結(jié)果不可避免地會(huì)存在一些偏倚。在今后研究中我們將積極與其他單位展開(kāi)合作,通過(guò)擴(kuò)大樣本量和提高研究人員的理論水平進(jìn)一步完善研究。

近年來(lái),PD-L1表達(dá)與腫瘤預(yù)后關(guān)系的研究主要集中于乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴瘤、直腸癌、腎癌等腫瘤,PD-L1表達(dá)與胰腺癌預(yù)后關(guān)系的研究相對(duì)較少。以往,PD-L1表達(dá)陽(yáng)性被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后不良的因素,包括非小細(xì)胞肺癌、腎癌、黑色素瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和卵巢癌[4,13-18]。而最近報(bào)道的三陰性乳腺癌與之前研究結(jié)果相反,PD-L1表達(dá)陽(yáng)性患者相對(duì)PD-L1陰性患者的預(yù)后較好,多因素分析證實(shí)PD-L1陽(yáng)性是三陰性乳腺癌OS的獨(dú)立影響因素[19]。同樣,結(jié)腸直腸癌[20]和黑色素瘤[21]的研究也表明PD-L1陽(yáng)性患者的預(yù)后較好。這些報(bào)道與我們的研究結(jié)果一致,PD-L1是影響術(shù)后胰腺癌患者OS的獨(dú)立因素,PD-L1陽(yáng)性的胰腺導(dǎo)管腺癌患者總體生存時(shí)間較長(zhǎng)。

胰腺癌PD-L1表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系目前仍存在爭(zhēng)論。Birnbaum等[22]認(rèn)為,腫瘤組織PD-L1染色陽(yáng)性與胰腺癌預(yù)后不良有關(guān)。我們分析這一相反的結(jié)論,可能是不同病理類型胰腺癌PD-L1的表達(dá)情況不同造成的。Birnbaum等[22]的研究對(duì)象包括胰腺導(dǎo)管腺癌在內(nèi)的所有病理類型的胰腺癌,而我們的研究對(duì)象只納入胰腺導(dǎo)管腺癌患者。其他病理類型胰腺癌與胰腺導(dǎo)管腺癌相比,PD-L1表達(dá)情況和預(yù)后均有差異,故可能得出相反的結(jié)論。此外,有學(xué)者認(rèn)為腫瘤組織表達(dá)PD-L1預(yù)后較差與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。既往也有報(bào)道指出,腫瘤組織PD-L1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞也存在相關(guān)性,例如:PD-L1陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌中存在大量腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞[23],而PD-L1陽(yáng)性黑色素瘤出現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的比例高達(dá)98%[8]。由于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞參與的抗腫瘤炎癥反應(yīng)是機(jī)體的保護(hù)機(jī)制,因此我們假設(shè):PD-L1陽(yáng)性胰腺癌患者預(yù)后較好,可能與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤炎癥反應(yīng)有關(guān)。這一假設(shè)與PD-L1參與腫瘤免疫逃逸的傳統(tǒng)觀點(diǎn)不同,或許可以解釋胰腺導(dǎo)管腺癌PD-L1陽(yáng)性患者OS長(zhǎng)于陰性患者。這一假設(shè)正確與否需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究加以證實(shí),這是我們今后開(kāi)展下一步研究的方向。