陳 筠，李志艷，趙 翀，劉 靜，張 欣，朱德銳*

(1.青海大學附屬醫(yī)院 口腔內科 西寧 810001；2.青海大學醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究中心 810016)

目前利用高通量測序技術(High throughput sequencing)開展微生物多樣性檢測、宏基因組學和微生物代謝組學方法來做口腔致病微生物的組成差異、種群結構研究，是國內外研究的熱點[1-3]。

研究者通過對海拔2 500 m以上的2 400名世居者及移居者進行牙周病學普查，發(fā)現(xiàn)土族移居者牙周病發(fā)病率高達98.7%，高于其他民族[4-6]。研究顯示，高原地區(qū)(海拔4500m)的居民口腔疾病發(fā)病率及病程進展速度顯著高于平原地區(qū)，牙周病的高發(fā)可能與其特殊的致病微生物的多樣性和組成有關。然而針對高原地區(qū)牙周病的致病微生物的研究報道相對較少，且結論不一。因此本研究以青海土族人群為研究對象，采用16S rRNA基因高通量測序技術初步探究青海土族牙周病患者口腔可疑致病微生物的組成差異和種群結構，為后期牙周病的預防、診斷與治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取和唾液采集

選取青海省互助土族自治縣威遠鎮(zhèn)小莊村的土族居民牙周病樣本10例。根據(jù)第三次全國口腔流行病學調查標準[7]收集慢性牙周炎患者樣本，牙周袋深度(PD)≥4 mm或附著喪失量(AL)≥2 mm，所有的選取對象無侵襲性牙周炎、口腔粘膜病、潰爛或智齒冠周炎等干擾本研究結果的疾病。就診前6個月內未做口腔治療。采樣前先囑受試者輕漱口，去除口腔中的食物殘渣，停止吞咽1 min后讓唾液(1.5mL)自行流入5 mL無菌EP管中，標記樣本為T1～T10，冰浴運輸，2 h內檢測完畢。

1.2 基因組DNA的提取及質量控制

樣本于0.22 μm細菌濾膜上進行真空抽濾，將濾膜剪碎放入DNA試劑盒(QI Aamp Fast DNA Stool Mini Kit)，參照試劑盒步驟提取基因組DNA，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析環(huán)境樣本DNA完整性。DNA質量純度檢測分析采用微量檢測儀Microplate Reader(USA，MD公司)，合格的總DNA樣品保存于-80 ℃冰箱。

1.3 PCR擴增和測序

使用16S rRNA基因通用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和785R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)進行V3-V4目的基因擴增細菌(ABI Gene Amp 9700，USA)，PCR反應條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min。采用Axyprep DNA Gel Extraction Kit(Axygen scientific，USA)行PCR擴增產(chǎn)物純化。采用Qubit?2.0熒光計(Invitrogen，USA)行DNA精準定量分析。檢測合格的PCR純化產(chǎn)物行16S rRNA基因高通量測序(MiSeq，美國ABI公司)，由上海惠研生物科技有限公司完成，每個樣本獲得的雙端序列數(shù)據(jù)為2～3萬個reads。根據(jù)測序reads之間overlap關系進行拼接(merge)，同時對reads質量和merge效果進行質控過濾(Q30>80%)，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列。

1.4 高通量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用QIIME1.8.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理，在相似度97%水平上聚類出可操作分類單元OTU(Operational taxonomic unit)，進行OTU picking和物種注釋分析。使用alpha稀釋曲線(Alpha rarefaction.py)計算樣品的菌群多樣性香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和菌種豐富度指數(shù)(Chao1)以及譜系多樣性(PD whole tree)和觀察物種(Observed species)種數(shù)，以及基于OTU進行主成分分析(PCA，principal component analysis)。根據(jù)分類學分析結果(綱、屬與種)分析微生物的群落結構、物種組成比例及豐度。

2 結果

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過Illumina MiSeq平臺進行土族口腔樣本高通量測序，獲得細菌的總有效序列Sequences為107 861條，平均長度為253 bp。在相似度97%水平上聚類可操作分類單元，并進行OTU picking，獲得青海土族牙周病患者口腔微生物的物種注釋OTUs數(shù)目為156個，不同樣本測序的可觀察物種和多樣性數(shù)據(jù)結果見表1。土族牙周病的可觀察物種OTUs有30～88個、豐度指數(shù)Chao1介于38.21～98.66、多樣性Shannon指數(shù)介于0.29～3.80，表明牙周病患者口腔內具有復雜的微生物生態(tài)結構。此外，牙周病組樣本間各多樣性指數(shù)因樣本個體的不同而存在差異。隨著樣本測序深度的增加，覆蓋度≥99.70%，表明測序足以可信地反映口腔微生物的存在現(xiàn)狀。

表1土族口腔微生物測序統(tǒng)計和多樣性分析表

Table 1 Sequencing statistics and diversity analysis of oral microorganisms in the Tu nationality

2.2 群落結構與物種豐度分析

通過在RDP數(shù)據(jù)庫進行相似性比對(156個細菌OTUs)，獲得分類地位明確的細菌共計7門12綱19目29科48屬57種，以及大量未確定分類地位(Unclassified)的細菌。分別在屬層次上對上述各樣品的物種豐度進行統(tǒng)計，有關結果顯示于圖1。分析表明，土族牙周病主要的優(yōu)勢屬群(豐度≥1%)是假單胞菌屬Pseudomonas、魏斯氏菌屬Weissella、嗜冷桿菌屬Psychrobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、乳球菌屬Lactococcus、克雷伯菌屬Klebsiella、不動桿菌屬Acinetobacter、腸桿菌科未知屬Enterobacteriaceae unclassified、腸桿菌屬Enterobacter、普羅維登斯菌屬Providencia、肉食桿菌屬Carnobacterium和明串珠菌屬Leuconostoc。以上分析顯示，牙周病患者口腔內微生物群落組成差異較大、種群結構復雜，優(yōu)勢類群在不同樣本中各有差異。

圖1青海土族牙周病組微生物群落結構組成圖

Figure1MicrobialcommunitystructureoftheperiodontaldiseasegroupsintheTunationalityfromQinghai

2.3 致病微生物分析

統(tǒng)計土族牙周病患者口腔內所有檢出微生物的相對豐度，結果見表2。所檢已知牙周病主要致病微生物種屬(豐度比例)有消化鏈球菌屬Peptostreptococcus(0.20%～5.50%)、微單胞菌屬Parvimonas(0.80%～1.90%)、卟啉單胞菌屬Porphyromonas(0.10%～0.20%)、普雷沃菌屬Prevotella(0.10%～14.80%)、擬桿菌屬Bacteroides(≤0.20%)、密螺旋體屬Treponema(0.10%～0.20%)和小類桿菌屬Dialister(2.80%～3.30%)。此外，還有大量可疑的致病微生物亦被檢出，按豐度依次為(≥0.5%)腸桿菌科未知屬Enterobacteriaceae unclassified、希瓦氏菌屬Shewanella、克雷伯氏菌Klebsiella、奈瑟氏菌屬Neisseria、嗜血桿菌屬Haemophilus、乳球菌屬Lactococcus、明串珠菌屬Leuconostoc、韋榮球菌屬Veillonella、普羅維登斯菌屬Providencia、鏈球菌屬Streptococcus、毛螺旋菌科未知屬Lachnospiraceae unclassified、葡萄球菌屬Staphylococcus、布雷德菌屬Bulleidia和肉食桿菌屬Carnobacterium。

表2土族牙周病組種群差異統(tǒng)計表

Table 2 Species statistics of periodontal disease group in Tu nationality

*：分類學地位尚不明確的屬；0：表示未檢出；#：文獻報道的已知致病微生物.

3 討論

目前，高通量測序是微生物多樣性研究的重要技術手段，微生物多樣性測序基于第二代高通量測序技術(Roche 454/MiSeq/HiSeq高通量測序)，測序精確，數(shù)據(jù)準確度高，可全面反映復雜樣品的微生物群落組成，以此可了解微生物群落與齲病、牙周病的相關性[8-9]。唾液樣本由于能夠提供整個口腔微生物群落信息，已作為診斷人體健康和口腔疾病的一種生物標記物[10-11]。本研究獲得土族牙周病患者口腔微生物的物種注釋OTU數(shù)目為156個，隸屬于7門12綱19目29科48屬57種，主要是放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、無壁菌門(Tenericutes) 7個門，此與吳芳[12]等研究的東鄉(xiāng)族牙周病人群相比，在OTU數(shù)量上有很大差異(60個OTU，共計6門27屬)，但Bacteroidetes、Fusobacteria、Firmicutes、Proteobacteria在兩個民族牙周病人群中均有檢出。同時，本研究發(fā)現(xiàn)牙周病患者口腔內的可觀察物種和豐度指數(shù)Chao1、多樣性指數(shù)Shannon及OTUs均高于或顯著高于平原地區(qū)土族患者，顯示不同海拔地區(qū)牙周病患者口腔內具有復雜的微生物群落結構，且是多種微生物(每個樣本>30種細菌)共存互作的結果。

口腔微生物常以群體的方式引起各種口腔疾病，群體中的每一個個體均參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，即使是低豐度的成員也可能作為復雜群落行為主要表現(xiàn)的關鍵物種[13]。比較分析土族牙周病的微生物種群差異，顯示土族牙周病患者口腔內的致病微生物種類繁多，同時與其他民族比，可疑性致病微生物較多(57種)。牙周炎是由牙菌斑中多種微生物引發(fā)的牙周組織慢性感染性炎癥疾病，其中卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、密螺旋體屬(Treponema)、坦納菌屬(Tannerella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、真桿菌屬(Eubacterium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、普氏菌屬(Prevotella)、Parvimonasmicra、小類桿菌屬(Dialister)、產(chǎn)線菌屬(Filifactor)、脫硫球菌屬(Desulfobulbus)及互養(yǎng)菌屬(Synergistes)等與該病密切相關[14]。本研究中，已檢測出明確的致病微生物包括Peptostreptococcus、Parvimonas、Porphyromonas、Prevotella、Bacteroides、Treponema和Dialister。此外，還有許多可疑的致病微生物亦被檢出，如Shewanella、Klebsiella、Neisseria、Haemophilus、Lactococcus、Leuconostoc、Veillonella、Bulleidia和Carnobacterium等。

青海土族牙周病患者口腔內的微生物群落結構和可疑致病微生物類群，與已有諸多報道不一致，可能由青海地區(qū)環(huán)境、氣候特征和飲食習慣差異造成。青海地處高海拔地區(qū)，鹽堿化環(huán)境是青海地區(qū)的主要特征，飲食奶制品和牛羊肉較多，這可能是牙周疾病高發(fā)的主要原因。本研究還檢出青海高原地區(qū)口腔特征微生物類群，如與乳酸發(fā)酵有關的乳桿菌屬Lactobacillus、乳球菌屬Lactococcus和明串珠菌屬Leuconostoc等，這可能和青海地區(qū)人群的飲食生活習慣有關；與地區(qū)鹽堿化環(huán)境有關的鹽單胞菌屬Halomonas以及與高原寒冷環(huán)境有關的Psychrobacter，該菌為革蘭陰性球桿菌，因嗜冷而得名，屬于莫拉菌科，廣泛存在于海洋和陸地環(huán)境，能夠在5 ℃下生長，一般在35 ℃～37 ℃范圍內不能生長，這可能是青海特殊環(huán)境形成的特有菌群[15]。

本研究顯示，青海土族牙周病患者口腔內Pseudomonas的含量較高，Pseudomonas多分布于土壤、淡水、海洋和生物體中，有極強分解有機物的能力，可以將多種有機物作為能量來源，生長溫度范圍較廣，可在4 ℃～43 ℃范圍內生長，大多數(shù)菌的最適溫度在30 ℃左右，生長pH范圍為7.0～8.5，且大部分屬于耐冷菌，這可能與青海地區(qū)特殊的低溫環(huán)境有關，具體的機制還需更深的研究[16]。

綜上所述，本研究初步揭示了青海土族牙周病患者口腔內的微生物組成特征及種群結構的復雜多樣性。土族牙周病的致病原因不僅有已知的牙周致病菌廣泛參與，還可能存在大量可疑致病菌的協(xié)同參與。