廖夢(mèng)姣，侯立朝，王志鑫，湯 鋒，王東旭，任 利，龐明泉，王海久，樊海寧*

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.青海省包蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001)

Treg細(xì)胞參與維持機(jī)體的免疫平衡，具有免疫負(fù)向調(diào)控作用[1-3]，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的標(biāo)記物，但Foxp3是細(xì)胞核蛋白，限定了Treg細(xì)胞的分離，也阻礙了對(duì)Treg細(xì)胞功能的進(jìn)一步研究[4]，在胃腸道疾病中發(fā)現(xiàn)CD127也是Treg細(xì)胞的表面標(biāo)記物，其CD127在CD4+的細(xì)胞中呈高表達(dá)(CD4+CD127high)。但在CD4+CD25high的細(xì)胞中CD127呈低表達(dá)(即CD4+CD25+CD127low)，在CD4+CD25highCD127lowTreg細(xì)胞中檢測(cè)到大于90%的細(xì)胞表達(dá)Foxp3，并且CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞能抑制T細(xì)胞的增值和功能[5]，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)Treg細(xì)胞在泡型包蟲(chóng)病中發(fā)揮作用[6]。但在泡型包蟲(chóng)病中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞是否表達(dá)Foxp3，及其在泡型包蟲(chóng)病的發(fā)展過(guò)程中存在何種意義，是否和CD4+CD25+Foxp3 Treg細(xì)胞一樣在泡球蚴感染中發(fā)揮免疫抑制作用，現(xiàn)有文獻(xiàn)未做闡述。本研究擬探討CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)及CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg在泡球蚴感染中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠18只，體重(20±2)g，購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001，NO.201722769]，隨機(jī)分成泡型包蟲(chóng)病組、健康對(duì)照組。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器

小鼠IFN-γ、IL-10、TGF-β1 ELISA試劑盒(Abcam公司)。抗體FITC Rat Anti-mouseCD4、PE Rat Anti-mouseCD25、APC Rat Anti-mouse CD127、BV421 Rat Anti-mouse Foxp3，同型對(duì)照FITCRat IgG2a、PE Rat IgG1、APC Rat IgG2b、BV421 Rat IgG2b，破膜液FIX/PERM(BD Biosciences公司)。小鼠淋巴細(xì)胞分離液(CEDARLANE公司)。青霉素-鏈霉素混合液(Gibco公司)。

5810R型離心機(jī)(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 泡型包蟲(chóng)病小鼠動(dòng)物模型的建立

從感染泡球蚴的沙鼠腹腔中，在無(wú)菌條件下采集含泡球蚴的囊塊，在生理鹽水(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素)中剪碎后，用300 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，收集下方的濾液，再用40 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾網(wǎng)上的泡球蚴，用生理鹽水(含0.8×103U/mL青霉素和1mg/mL鏈霉素)清洗數(shù)次，泡球蚴的成活率占95%以上(鏡下觀察)。

泡型包蟲(chóng)病組(9只)：小鼠腹腔注射泡球蚴(生理鹽水將原頭蚴配成20%的濃度)200 μL。

健康對(duì)照組(9只)：小鼠腹腔注射生理鹽水200 μL。

1.2.2 CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3 Treg細(xì)胞的檢測(cè)

動(dòng)物模型建立3個(gè)月后，分別取泡型包蟲(chóng)病組與健康對(duì)照組脾臟研磨，提取淋巴細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將100 μL細(xì)胞懸液加入流式管，再加入FITC Rat Anti-mouse CD4 4 μL、PE Rat Anti-mouse CD25 10 μL、APC Rat Anti-mouse CD127 5 μL避光孵育20 min，同型對(duì)照加FITC Rat IgG2a 5 μL、PE Rat IgG1 5 μL、APCRat IgG2b 5 μL避光孵育20 min，加入破膜液FIX/PERM 500 μL 避光孵育30 min，離心(400g)5 min，棄上清液，加入1×Wash buffer 1 mL清洗，再次離心(400g)5 min，棄上清液，加入胞內(nèi)抗體BV421 Rat Anti-mouse Foxp3 5 μL，同型對(duì)照加BV421 Rat IgG2b 5 μL避光孵育30 min，離心(400g)5 min，棄上清液，加入1×Wash buffer 500 μL上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3 Treg及CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞中Foxp3的含量。

1.2.3 細(xì)胞因子的檢測(cè)

眼球采血收集小鼠血液，靜置4 h，離心(2500g)20 min，收集血清，用ELISA法測(cè)定泡型包蟲(chóng)病組、健康對(duì)照組血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1水平。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 泡型包蟲(chóng)病組病灶大小

將泡型包蟲(chóng)病組小鼠處死，取出病灶測(cè)量大小，為(1.05±0.58)g。

2.2 健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組CD4+CD25+CD127low Treg、CD4+CD25+Foxp3 Treg細(xì)胞的含量

將小鼠脾臟研磨提取淋巴細(xì)胞后加入抗體上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，健康對(duì)照組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞為9.04±2.78，泡型包蟲(chóng)病組為14.91±4.21(P<0.004 V.S.健康對(duì)照組)，健康對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3Treg細(xì)胞為0.76±0.73，泡型包蟲(chóng)病組為4.21±2.08(P<0.000V.S.健康對(duì)照組)(表1，圖1)。

表1健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3Treg細(xì)胞的含量

Table 1 The content of CD4+CD25+CD127low Treg and CD4+CD25+Foxp3 Treg in the control group andalveolar echinocococosis group

A為健康對(duì)照組，B為泡型包蟲(chóng)病組，C為健康對(duì)照組，D為泡型包蟲(chóng)病組

圖1健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組中CD4+CD25+CD127lowTreg、CD4+CD25+Foxp3Treg細(xì)胞含量圖

Figure1ThecontentofCD4+CD25+CD127lowTregandCD4+CD25+Foxp3Tregincontrolgroupandalveolarechinocococosisgroup

2.3 CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)量

健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組脾淋巴細(xì)胞在P3門(mén)下檢測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞中Foxp3的含量(圖1)，健康對(duì)照組中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞中Foxp3的含量為70.7%，泡型包蟲(chóng)病組為67.7%，泡型包蟲(chóng)病組與健康對(duì)照組中CD4+CD25+CD127lowTreg高表達(dá)Foxp3(圖2)。

A：健康對(duì)照組 B：實(shí)驗(yàn)組

圖2健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞中Foxp3的含量圖

Figure2Foxp3contentinCD4+CD25+CD127lowTregsincontrolgroupandalveolarechinocococosisgroup

2.4 泡型包蟲(chóng)病組CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞與病灶大小的相關(guān)性

泡型包蟲(chóng)病組中脾淋巴細(xì)胞CD4+CD25+CD127lowTreg的含量與病灶大小進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，兩指標(biāo)呈正相關(guān)，r=0.894，P=0.01(圖3)。

圖3實(shí)驗(yàn)組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞與病灶大小相關(guān)性分析圖

Figure3CorrelationAnalysisbetweencontentofCD4+CD25+CD127lowTregandsizeoflesioninalveolarechinocococosisgroup

2.5 泡型包蟲(chóng)病組CD4+CD25+Foxp3 Treg細(xì)胞與病灶大小的相關(guān)性

泡型包蟲(chóng)病組中脾淋巴細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3 Treg細(xì)胞的含量與病灶大小進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，兩指標(biāo)呈正相關(guān)，r=0.714，P=0.031(圖4)。

圖4實(shí)驗(yàn)組CD4+CD25+Foxp3Treg細(xì)胞含量與病灶大小相關(guān)性分析圖

Figure4CorrelationanalysisbetweencontentofCD4+CD25+Foxp3TregandsizeoflesioninalveolarechinocococosisGroup

2.6 健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組血清IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表達(dá)水平

健康對(duì)照組與泡型包蟲(chóng)病組小鼠分別進(jìn)行眼球采血，離心(2500g，20min)取血清行ELISA檢測(cè)，健康對(duì)照組IFN-γ為8.39±0.82，泡型包蟲(chóng)病組為560.95±123.71(P<0.000V.S.健康對(duì)照組)。健康對(duì)照組IL-10為 538.52±55.82，泡型包蟲(chóng)病組為1946.80±260.89(P<0.000V.S.健康對(duì)照組)。健康對(duì)照組TGF-β1為 223.90±56.34，泡型包蟲(chóng)病組為 321.35±36.44(P<0.001V.S.健康對(duì)照組)(表2)。

表2泡型包蟲(chóng)病組與健康對(duì)照組血清中IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表達(dá)水平

Table 2 The levels of IFN-γ、IL-10、TGF-β1 in serum in alveolar echinocococosis group and control group

3 討論

本研究通過(guò)采用泡球蚴感染小鼠的動(dòng)物模型觀察CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞對(duì)Foxp3的表達(dá)及CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg在感染泡球蚴小鼠中作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泡球蚴感染的小鼠刺激CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細(xì)胞增殖，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞高表達(dá)Foxp3，CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細(xì)胞能促進(jìn)泡型包蟲(chóng)病的發(fā)展。

近幾年對(duì)Treg細(xì)胞的鑒別及特異性標(biāo)記物一直都有爭(zhēng)議，活化標(biāo)記物CD25不僅僅表達(dá)在Treg細(xì)胞上，也表達(dá)在活化的T細(xì)胞上。因此，不能通過(guò)CD25從活化的T細(xì)胞中區(qū)分出Treg細(xì)胞，CD25和Treg細(xì)胞的其他標(biāo)記物如GITR、CTLA-4和CD45RB并不是在所有活化的CD4+細(xì)胞上都有表達(dá)[7-8]，近幾年Foxp3作為T(mén)reg的標(biāo)記物。但其是核內(nèi)蛋白，限定了Treg細(xì)胞的體外分離及其進(jìn)一步的功能研究，在胃腸道疾病中研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)表面標(biāo)記物CD127聯(lián)合CD4+CD25+分離的CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞高表達(dá)Foxp3。并具有免疫抑制作用，其可作為T(mén)reg細(xì)胞的表面標(biāo)記物[9]。本研究以小鼠動(dòng)物模型為載體，觀察CD4+CD25+CD127lowTreg對(duì)Foxp3的表達(dá)，結(jié)果顯示，不管是健康小鼠還是泡型包蟲(chóng)病小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞都高表達(dá)Foxp3，證實(shí)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞在泡型包蟲(chóng)病中也可作為T(mén)reg細(xì)胞的表面標(biāo)記物。

Treg細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞間的接觸和分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)與效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)的表面配體細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、可誘導(dǎo)共刺激因子(ICOS)和程序性死亡分子1(PD-1)結(jié)合，抑制Teff的功能[10]，從而降低機(jī)體的免疫功能。Treg細(xì)胞還可分泌TGF-β1、IL-10來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用，TGF-β1抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和Th1、Th2細(xì)胞的分化，同時(shí)促進(jìn)外周Treg、Th17、Th9、Tfh細(xì)胞產(chǎn)生[11]。而白細(xì)胞介素(IL)-10是抑制抗原呈遞和促炎細(xì)胞因子釋放的調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子[12]，我們實(shí)驗(yàn)顯示泡球蚴感染的小鼠刺激CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細(xì)胞增殖，同時(shí)顯示Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-10和TGF-β1)顯著升高、CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細(xì)胞含量與病灶的大小呈正相關(guān)。

綜上所述，我們可以初步推測(cè)：泡型包蟲(chóng)病小鼠CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞高表達(dá)Foxp3，在泡型包蟲(chóng)病中可作為T(mén)reg細(xì)胞的表面標(biāo)記物；CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細(xì)胞能促進(jìn)泡型包蟲(chóng)病的發(fā)展，同時(shí)初步揭示CD4+CD25+CD127low/Foxp3 Treg細(xì)胞在泡型包蟲(chóng)病的作用機(jī)制可能與抑制機(jī)體的免疫功能有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的樣本量少，并且機(jī)體免疫包括非特異性免疫和特異性免疫，它們之間并非孤立存在，而是存在密切的聯(lián)系。因此，對(duì)于泡型包蟲(chóng)病的發(fā)病機(jī)制的研究，需要大量的、更深入的研究去闡明。