基于非線性動力學方法研究鈣離子在針刺神經(jīng)電信號傳導中的作用

陳靜子,劉陽陽,劉喆,郭義,郭永明

(1.天津市南開醫(yī)院,天津300100;2.天津中醫(yī)藥大學,天津301617;3.浙江中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,杭州310005)

針灸學作為中醫(yī)學科體系中最具特色和優(yōu)勢的學科,以其獨特的理論體系和治療方法豐富了世界醫(yī)藥衛(wèi)生學知識。對針灸作用原理的研究一直是學者們多年來的研究重點,其中針刺信息的傳導更是針灸研究中關(guān)鍵科學問題之一。以往對于針刺信息的研究大多是從形態(tài)學角度研究針刺信息的傳導媒介,而從化學角度進行的研究較少。既往研究表明,化學物質(zhì)的傳導是生物體內(nèi)信息傳導的重要途徑之一,如神經(jīng)動作電位的傳導機理、激素作用原理的闡明等。因此,從化學角度研究針刺信息的傳導是針刺信息研究的重要途徑之一。在眾多的化學物質(zhì)中,鈣離子(Ca2+)在許多生命活動中發(fā)揮著重要作用。在神經(jīng)細胞遷移和軸突導向中,Ca2+也是一個很重要的信號分子[1],由Ca2+參與的細胞信號系統(tǒng)被認為是神經(jīng)系統(tǒng)整合的分子機制之一[2],且Ca2+與經(jīng)絡(luò)活動具有非常密切的關(guān)系,是構(gòu)成經(jīng)絡(luò)活動的關(guān)鍵因素之一。本課題組前期工作中,在不同動物、不同模型上均觀察到改變針刺部位的Ca2+濃度可以使針效喪失或減弱,結(jié)果具有一定的普遍性[3-6]。針刺作為一種微創(chuàng)性物理刺激作用于人體時,最迅速、直接的反應(yīng)就是對神經(jīng)系統(tǒng)的影響。在針刺過程中,神經(jīng)起著不可或缺的作用,其中外周神經(jīng)是針刺即刻有效信號的重要傳入途徑之一,阻滯針刺穴位神經(jīng)對針刺效應(yīng)有明顯的抑制作用[7-8]。穴位作為針刺信號的起始部位,針刺信號通過穴位局部的感受器及神經(jīng)末梢的興奮傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。針感的產(chǎn)生可能有兩方面的原因,一是針刺直接機械作用于神經(jīng)末梢裝置;二是針刺引起穴位組織中化學成分的改變或組織細胞顆粒釋放生物活性物質(zhì)作用于神經(jīng)末梢裝置而將針刺刺激信號轉(zhuǎn)換為神經(jīng)沖動[9-10]。足三里穴作為臨床常用穴位,針刺足三里穴時,可在人和動物體內(nèi)產(chǎn)生電信號或使電信號發(fā)生變化,相關(guān)研究已取得一定的結(jié)果[11-12]。因此,本文以足三里穴作為刺激點,以神經(jīng)反應(yīng)作為切入點進行研究,采用鈣離子絡(luò)合劑[乙二醇雙乙胺醚四乙酸(EGTA)溶液]穴位注射絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+,分別記錄穴位注射前及穴位注射后即刻、7 min、14 min、21 min、28min時針刺足三里穴外周傳入通路脊髓背根神經(jīng)細束的電信號,并應(yīng)用非線性時間序列和小波能量熵等方法分析,研究Ca2+對針刺神經(jīng)電信號的影響,為揭示Ca2+在針刺信號傳導過程中的作用及針效產(chǎn)生的始動機制進一步提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用清潔級雄性 SD大鼠,體重為180～210g,許可證號[SCXK(京)2007-0001]。

1.2 實驗方法

大鼠麻醉(20%烏拉坦,1.5g/kg腹腔麻醉)后,取俯臥位固定,沿后背正中線剪開T13-L6段對應(yīng)的背部皮膚,分離去除皮下筋膜,剔除T13-L5椎體兩側(cè)附著的豎脊肌,用骨鉗剔除T13-L5脊椎棘突和橫突,暴露出脊髓。在解剖顯微鏡下剝離硬脊膜,以皮瓣縫合成油槽,用37℃的石臘油覆蓋保溫、防干燥。鏡下分離L4脊髓背根神經(jīng)并在近心端剪斷,分離至感受野的敏感點在足三里穴位區(qū)的神經(jīng)細束,將其搭放在雙極鉑金絲記錄電極上,記錄此刻的神經(jīng)細束放電,行平補平瀉提插法,幅度約 0.3cm,頻率120次/min,操作時間為 2min,作為穴位藥物注射后放電的對照。實驗組穴位注射0.1mol/L EGTA 5μL絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+;對照組穴位注射0.05 mol/L Ca2+-EGTA對照液5 μL。同上述方法記錄穴位注射前及穴位注射后即刻(YH0)、7min(YH7)、14 min(YH14)、21 min(YH21)、28 min(YH28)時神經(jīng)細束的放電情況。傳入單位放電經(jīng)MP150生物信號采集系統(tǒng)采集記錄并進行分析處理。利用非線性時間序列分析方法、小波能量熵分析法、峰峰間期等方法對采集的數(shù)據(jù)進行分析。實驗設(shè)計如圖1所示。

圖1 實驗設(shè)計圖

1.3 數(shù)據(jù)記錄

實驗整體記錄了23組有效實驗數(shù)據(jù),其中實驗組17組,對照組6組。采樣頻率為4kHz,在分析中每個時間段截取60s,即240萬采樣點進行分析。因為實驗中采集的信號——脊髓背角神經(jīng)束為實驗操作者隨機剝離,是多個神經(jīng)元放電的累加,非單神經(jīng)元采集的放電,故我們首先需要將幾個神經(jīng)元的累加信號進行分離,即信號類選算法(sorting)。

1.4 分析方法

①首先對針刺峰放電序列進行基本特征分析,統(tǒng)計每個定長時間段中放電個數(shù),比較穴位注射前后放電個數(shù)變化情況;統(tǒng)計每個時間段峰放電序列放電幅值的平均值,比較穴位注射前后的變化情況;統(tǒng)計每個時間段峰峰間期(interspike intervals, ISI)序列的變異系數(shù),同樣進行對比。②其次對針刺電信號進行非線性特征提取,計算原始電信號的功率譜和ISI序列的Lyapunov指數(shù),提取ISI序列的關(guān)聯(lián)維數(shù)以及分析放電脈沖序列的LZ復(fù)雜度,比較穴位注射前后峰放電的變化情況。③再對針刺電信號進行小波能量熵分析,比較穴位注射前后各時間段熵值變化情況,說明Ca2+濃度降低對于針刺電信號的影響。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用兩獨立樣本秩和檢驗,組內(nèi)不同時段比較采用配對樣本秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

實驗結(jié)果中YQ表示穴位注射藥物前;YH0表示穴位注射后即刻;YH7表示穴位注射后第7分鐘;YH14表示穴位注射后第14分鐘;YH21表示穴位注射后第21分鐘;YH28表示穴位注射后第28分鐘。

2.1 基礎(chǔ)統(tǒng)計分析

2.1.1 放電頻率統(tǒng)計分析

由表1可見,實驗組各時間段(YH0、YH21、YH28)的放電頻率均降低,與同組YQ比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);對照組各時間段(YH14、YH21、YH28)的放電頻率增高,與同組YQ比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組YH21、YH28的放電頻率與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.1.2 波形幅值統(tǒng)計分析

由表2可見,實驗組YH7、YH14的放電波幅均降低,與同組YQ比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);實驗組YH14的放電波幅與同組YH0比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照組YH21的放電波幅增高,與同組YQ比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);對照組YH28的放電波幅與同組YH0比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗組各時間段(YH0、YH7、YH14、YH21、YH28)的放電波幅與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 兩組各時間段放電頻率比較(±s)

表1 兩組各時間段放電頻率比較(±s)

注:與同組YQ比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與對照組比較3)P＜0.05

組別nYQ YH0YH7YH14YH21YH28實驗組58917.53±596.05510.88±292.121)691.82±600.20586.35±369.46448.06±268.501)3)488.41±390.331)3)對照組59603.67±294.83718.00±395.99672.33±273.34 763.83±250.622)837.33±424.782)910.33±480.782)

表2 兩組各時間段放電波幅比較(±s)

表2 兩組各時間段放電波幅比較(±s)

注:與同組YQ比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與對照組比較3)P＜0.05

組別nYQYH0YH7YH14YH21YH28實驗組580.16±0.150.13±0.103)0.09±0.031)3)0.07±0.021)2)3)0.09±0.063)0.07±0.053)對照組590.22±0.080.24±0.090.25±0.120.27±0.140.30±0.181)0.31±0.222)

2.1.3 ISI統(tǒng)計分析

ISI序列是神經(jīng)電信號最基本的特征之一,生物學家認為其攜帶著生物信息的主要元素,神經(jīng)科學學者將ISI序列作為研究神經(jīng)信息編碼的基本方法。為顯示兩組各時間段ISI的方差系數(shù)(coefficientof variation,CV)均值變化情況,對樣本進行歸一化,得到如圖 2所示的 CV變化趨勢。可以看出,實驗組 YQ的CV與注射后初始階段基本相同,后期ISI變異性變大。圖3為對照組各時間段CV變化趨勢,可見各時間段的變異系數(shù)處于一個極小的變化范圍,與實驗組有明顯不同。

圖2 實驗組穴位注射前后各時間段ISI序列CV均值

圖3 對照組穴位注射前后各時間段ISI序列CV均值

2.2 針刺電信號的非線性動力學分析

2.2.1 功率譜

對原始針刺電信號進行功率譜分析,它是從能量的角度提取信號的頻率信息。周期運動的功率譜是分立的、離散的,對應(yīng)于尖峰;擬周期運動的功率譜包括各種頻率,對應(yīng)于有限數(shù)目的峰值,非周期運動的功率譜是連續(xù)的,故功率譜分析成為觀測混沌的重要方法。對穴位注射前后不同時段數(shù)據(jù)進行功率譜計算,也得到了上面所述的現(xiàn)象,出現(xiàn)了連續(xù)峰值,具有混沌的特征。

圖4為實驗組17組穴位注射EGTA溶液前后各時間段功率譜的均值,加粗紅線代表穴位Ca2+濃度正常時(YQ)的針刺電信號功率譜。可以看到EGTA絡(luò)合穴區(qū)Ca2+后,針刺電信號的功率譜在高頻部分升高。圖5為對照組各時間段功率譜的均值,加粗紅線同樣代表YQ這一時段的功率譜,可以看到在頻率＞5000 Hz的部分與實驗組不同,未顯示隨時間先升后降的趨勢。

圖4 實驗組穴位注射前后各時間段功率譜比較圖

圖5 對照組穴位注射前后各時間段功率譜比較圖

2.2.2 關(guān)聯(lián)維數(shù)分析

應(yīng)用關(guān)聯(lián)維數(shù)D2提取兩組穴位注射前后各時間段針刺足三里穴脊髓背根電信號的分形混沌特征,維數(shù)相對越大,系統(tǒng)相對越復(fù)雜。隨著時間的流逝,信息損失的速率越快,產(chǎn)生的新信息越多。

由圖6可見,實驗組穴位注射前ISI序列的關(guān)聯(lián)維數(shù)小于穴位注射后ISI序列的關(guān)聯(lián)維數(shù),有一個遞增的趨勢,而后關(guān)聯(lián)維數(shù)又遞減到穴位注射前水平。圖7為對照組各時間段ISI序列關(guān)聯(lián)維數(shù),變化較大,未呈現(xiàn)類似實驗組受Ca2+濃度變化產(chǎn)生的變化規(guī)律。

圖6 實驗組穴位注射前后各時間段ISI序列關(guān)聯(lián)維數(shù)均值

圖7 對照組穴位注射前后各時間段ISI序列關(guān)聯(lián)維數(shù)均值

2.2.3 Lyapunov指數(shù)分析

通過求取Lyapunov指數(shù)來判別ISI序列是否為隨機的,Lyapunov指數(shù)刻畫了系統(tǒng)對初始條件的敏感依賴性,即在相空間中具有近乎相同的初始狀態(tài)的軌線以指數(shù)增長的方式相互分離的性質(zhì),初值敏感性使混沌系統(tǒng)呈現(xiàn)出許多看似與隨機系統(tǒng)相同的長期特性,但只有在混沌的系統(tǒng)當中才能觀察到正的Lyapunov指數(shù),隨機信號的Lyapunov指數(shù)為零。

圖8為實驗組各時間段ISI序列Lyapunov指數(shù)歸一化后的均值變化情況,有一個先降低后恢復(fù)的過程,YQ段Lyapunov指數(shù)高于YH段且后期未恢復(fù)到Y(jié)Q水平。圖9為對照組各時間段ISI序列Lyapunov指數(shù),該組未呈現(xiàn)實驗組的變化趨勢。

2.3 針刺電信號的小波信息熵分析

在信息論中,熵表示每個符號所提供的平均信息量和信源的平均不確定性,它能提供關(guān)于信號潛在的動態(tài)過程的有用信息。事實上,對于一個單一頻率的周期信號,除了包含這個典型信號頻率的小波尺度,所有的其他小波系數(shù)幾乎都是零。對于這個特殊的尺度,小波系數(shù)將接近于1,而此時信號的熵值將接近于0或者是一個很小的值。相反,由一個完全無序的過程生成的信號(例如隨機信號),在所有的頻段上都有小波系數(shù),而且數(shù)值大小并無明顯差別,此時信號的熵值將接近于1;同時,信號的概率分布越接近這種無序的分布,其熵值也就越大,信號熵值的大小反映了概率分布的均勻性。如果把小波變換的系數(shù)矩陣處理成一個概率分布序列,由它計算得到的熵值就反映了這個系數(shù)矩陣的稀疏程度,也就是信號概率分布的有序程度,這種熵就稱作小波熵。因為各樣本數(shù)據(jù)之間小波能量熵差異較大,為了進行比較,同上做歸一化處理。

由圖10可見,實驗組穴位注射EGTA前脊髓背根針刺電信號的小波能量熵明顯高于注射后。圖11為對照組各時間段平均小波能量熵,可以看到其小波能量熵或處于基本不變的趨勢或是增加,與實驗組呈明顯相反的變化趨勢,也說明了Ca2+濃度減低對于針刺電信號的影響。

圖8 實驗組穴位注射前后各時間段ISI序列Lyapunov指數(shù)均值

圖9 對照組穴位注射前后各時間段ISI序列Lyapunov指數(shù)均值

圖10 實驗組穴位注射前后各時間段ISI序列小波能量熵均值

圖11 對照組穴位注射前后各時間段ISI序列小波能量熵均值

3 討論

針刺電信息的傳入方式分為兩種,一種是經(jīng)神經(jīng)纖維直接向中樞傳遞;另一種是基于神經(jīng)-化學接力聯(lián)動假說[13]。針刺穴位后,針刺信息由外周傳入道路進入中樞有關(guān)各級腦部,經(jīng)中樞整合調(diào)制后,通過傳出途徑對臟腑器官的活動和痛反應(yīng)進行調(diào)節(jié)和控制[14]。已有實驗證明,由外周傳入神經(jīng)通路傳入的針刺信息,通過各級中樞作用后轉(zhuǎn)換為傳出神經(jīng)沖動,其神經(jīng)沖動沿脊髓背外側(cè)索下行至有關(guān)節(jié)段,對脊髓背角、中間外側(cè)角及前角神經(jīng)元發(fā)生作用,作用后的神經(jīng)沖動再沿相應(yīng)的軀體運動神經(jīng)或植物神經(jīng)傳至各自的效應(yīng)器,引起其功能活動的各種變化。針刺穴位后可能引起多種反應(yīng),通過多種途徑來產(chǎn)生針刺效應(yīng),而Ca2+在針刺效應(yīng)的信息傳導中起到關(guān)鍵作用,可能是針刺效應(yīng)產(chǎn)生的一個重要環(huán)節(jié)。既往研究結(jié)果表明,在神經(jīng)細胞遷移和軸突導向中Ca2+也是一個很重要的信號分子[1],由Ca2+參與的細胞信號系統(tǒng)被認為是神經(jīng)系統(tǒng)整合的分子機制之一[2],且Ca2+與經(jīng)絡(luò)活動具有非常密切的關(guān)系,是構(gòu)成經(jīng)絡(luò)活動的關(guān)鍵因素之一。大鼠腦缺血后,缺血區(qū)細胞外游離Ca2+很快流入細胞內(nèi),腦缺血后20min已形成細胞內(nèi)鈣超載。現(xiàn)代研究證明,神經(jīng)元內(nèi)鈣超載是導致神經(jīng)元壞死的關(guān)鍵因素[15]。經(jīng)手十二井穴點刺放血法治療的大鼠,從針刺后第8分鐘就開始明顯抑制細胞外游離Ca2+的內(nèi)流,其趨勢與時間呈正相關(guān),至第20分鐘細胞內(nèi)鈣超載已有所緩解。所以,腦缺血超早期應(yīng)用手十二井穴點刺放血法進行干預(yù)可快速起效,起到調(diào)節(jié)缺血區(qū)腦細胞內(nèi)外游離Ca2+濃度,有效抑制神經(jīng)元內(nèi)鈣超載,保護腦細胞功能的作用[16]。目前許多研究也表明,針刺可在機體自穩(wěn)機制下,在生理功能最大調(diào)節(jié)極限范圍內(nèi),調(diào)節(jié)Ca2+活性的生理濃度,使其趨于平衡,盡早促進疾病由病理狀態(tài)向正常生理狀態(tài)轉(zhuǎn)化,從而達到扶正祛邪、以平為期的目的[17-18]。針刺刺激的初始應(yīng)答部位主要是穴位局部,同時穴位局部又是針刺的物理信息向生物有效信息轉(zhuǎn)換的初始部位,針刺信息的整個轉(zhuǎn)化過程又在穴位處被放大[19],能夠?qū)εR床后續(xù)針刺效應(yīng)發(fā)揮重要作用。因此,從穴位局部入手,研究針刺效應(yīng)的初始動力學調(diào)控機制,將有助于揭示針刺作用原理及機制。本課題組前期研究工作表明,Ca2+與肥大細胞都是針效產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[20-21]。郭義等[22]發(fā)現(xiàn)穴處的Ca元素可能存在富集;針刺可引起穴位及經(jīng)脈線上Ca2+濃度變化[23-25]。裴瑩等[26]采用EGTA絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+后,采用光鏡觀察穴區(qū)肥大細胞的形態(tài)學變化,研究在針效產(chǎn)生中鈣離子與肥大細胞兩者相互作用的關(guān)系,結(jié)果顯示機體在胃損傷狀態(tài)下,針刺能夠促進足三里穴位周圍的肥大細胞脫顆粒。絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+后,針刺不能對機體的穴區(qū)皮膚、肌肉處的肥大細胞脫顆粒。且絡(luò)合穴區(qū)Ca2+時的EGTA濃度越高,針刺后機體穴區(qū)皮膚、肌肉處脫顆粒的肥大細胞數(shù)量越少,同時肥大細胞脫顆粒率越低。在針刺過程中,機體穴位處受針刺刺激后,針刺局部可能會產(chǎn)生類似炎性反應(yīng),穴位結(jié)締組織牽張釋放Ca2+等化學物質(zhì),Ca2+濃度升高,激活肥大細胞,促使肥大細胞脫顆粒,釋放組胺等炎性介質(zhì),并使毛細血管擴張,通透性增加而引起神經(jīng)、免疫等細胞反應(yīng),Ca2+等化學物質(zhì)循經(jīng)傳送等一系列化學反應(yīng)。另外,我們知道Ca2+與神經(jīng)細胞之間關(guān)系密切,Ca2+可以引起神經(jīng)沖動,能有效調(diào)控突觸前和突觸后的調(diào)節(jié)機制,具有可控制突觸后離子通道的功能和逆行抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放機制的雙重調(diào)節(jié)機制[27-29]。EGTA是一種氨羧配位劑,可以與金屬離子形成配合物,它與Ca結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變,形成穩(wěn)定的EGTA鈣配合物。因此,本研究實驗組以EGTA穴位注射絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+,對照組以Ca2+-EGTA絡(luò)合液作為對照液,通過觀察兩組穴位注射前后各時間段針刺電信號的變化,研究Ca2+對針刺神經(jīng)電信號的影響特征和規(guī)律,揭示Ca2+在針刺信號傳導過程中的作用,為針效產(chǎn)生的始動機制進一步提供實驗依據(jù)。應(yīng)用生物電工學的部分分析方法對針刺電信號峰放電序列進行基本特征分析、非線性特征提取和小波能量熵分析,比較穴位注射前后各時間段數(shù)值的變化情況,結(jié)果提示EGTA溶液絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+能夠明顯降低支配該穴區(qū)的脊髓背根神經(jīng)細束放電頻率和波幅。說明Ca2+在針刺神經(jīng)電信號傳導過程中起著重要作用。絡(luò)合足三里穴區(qū)Ca2+后再行針刺,支配該穴區(qū)的脊髓背根神經(jīng)細束放電頻率、波形幅值,及非線性分析結(jié)果等都與對照組存在明顯區(qū)別。本研究結(jié)果再次證明了穴區(qū)Ca2+濃度是針效產(chǎn)生的關(guān)鍵因素,是經(jīng)絡(luò)活動的重要物質(zhì)基礎(chǔ),提示神經(jīng)細胞、Ca2+與針刺之間的信號傳遞可能是針效產(chǎn)生始動機制的主要環(huán)節(jié)之一,這種信號傳遞的過程可以開啟神經(jīng)-體液的針刺信號轉(zhuǎn)導、傳導,經(jīng)中樞整合后激活神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),從而作用于效應(yīng)器官并最終產(chǎn)生針刺效應(yīng)。

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