半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達(dá)特性*

宋雪松 徐永江 柳學(xué)周 史 寶 王 濱 劉永山 張雅星

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半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達(dá)特性*

宋雪松1,2徐永江1柳學(xué)周1①史 寶1王 濱1劉永山1,2張雅星1,2

(1. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

利用RT-PCR和RACE方法獲得了半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ的cDNA全長序列，并采用定量PCR技術(shù)分析了其組織表達(dá)特性。半滑舌鰨RARα cDNA序列全長為1823 bp，編碼443個(gè)氨基酸；RARγ cDNA序列全長為1959 bp，編碼489個(gè)氨基酸。同源性分析顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ同源性高達(dá)60.8%，與牙鲆()同源性高達(dá)97.0%，具有較強(qiáng)的進(jìn)化保守性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ分別歸屬于單獨(dú)的分支，且與其他魚類聚合成簇。組織表達(dá)分析顯示，RARα mRNA在腎中表達(dá)量最高，而RARγ mRNA在脾中表達(dá)量最高，RARα和RARγ mRNA在其他組織中均有表達(dá)，表明半滑舌鰨2種RAR都可能參與多種生理過程調(diào)控。半滑舌鰨2種RAR mRNA在有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)正常皮膚中的表達(dá)量依次升高，且發(fā)現(xiàn)RARα在正常有眼側(cè)皮膚的表達(dá)高于RARγ，而RARγ在無眼側(cè)正常皮膚中的表達(dá)顯著高于RARα，無眼側(cè)黑化皮膚中RARα表達(dá)高于RARγ。RAR基因在有眼側(cè)和無眼側(cè)皮膚組織中的差異表達(dá)可能和RA/RAR系統(tǒng)調(diào)節(jié)體色有關(guān)。

半滑舌鰨；視黃酸受體；基因克??；表達(dá)模式；無眼側(cè)黑化

視黃酸(Retinoic acid, RA)是一種脂溶性小分子物質(zhì)，又稱維甲酸，是維生素A(VA)在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過一系列水解和酶催化作用生成的最終代謝產(chǎn)物。視黃酸合成進(jìn)入細(xì)胞后先與重組人胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白-1 (CRABP1)和CRΑBP2蛋白結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，形成核受體二聚體，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)(Budhu, 2002)。RA的作用是通過定位在靶細(xì)胞核內(nèi)的特異性受體介導(dǎo)的。目前，已發(fā)現(xiàn)兩類視黃酸受體：視黃酸受體(RAR)和視黃酸X受體(RXR)，作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子(Chambon, 1996)。RAR是一類細(xì)胞核受體，屬于類固醇和甲狀腺激素受體超家族，其通過與RXR形成異源二聚體(RAR/RXR)，增加與視黃素應(yīng)答元件的親和力，由此加強(qiáng)本身的轉(zhuǎn)錄活性和對(duì)配體的敏感性(Kliewer, 1992; Hallenbeck, 1992)。哺乳動(dòng)物RAR有3種亞型：RARα、RARβ和RARγ，配體為順式視黃酸(9-cis-RA)和反式視黃酸(ATRA)(Brand, 1988)，但魚類中目前沒有發(fā)現(xiàn)RARβ亞型的存在(Jones, 1995)。研究發(fā)現(xiàn)，RA/RAR系統(tǒng)具有抑制腫瘤生長、保護(hù)上皮組織、促進(jìn)胚胎骨骼心臟功能和視覺發(fā)育功能(De Luca, 1991; Zhou, 2017; Isojima, 2014)，并且在抑制細(xì)胞凋亡(Herget,1998)和免疫調(diào)節(jié)(Erkelens, 2017)也有重要生理作用，是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要因子。

RA及其受體RAR系統(tǒng)在魚類中的研究較少(Faehnrich, 2016; Zhang, 2013; 冷向軍, 2017)。在鲆鰈類中，RA/RAR系統(tǒng)對(duì)牙鲆()骨骼發(fā)育和眼睛位移等變態(tài)發(fā)育過程(Haga, 2002; Martinez, 2007)，對(duì)塞內(nèi)加爾鰨()(Ignacio, 2009)和大西洋庸鰈()(Lewis-McCrea, 2010)骨骼發(fā)育畸形都具有重要的生理調(diào)控作用。對(duì)牙鲆的研究表明，利用9-cis-RA或者ATRA處理變態(tài)前仔魚，可以通過RA/RAR信號(hào)通路的介導(dǎo)作用抑制魚苗眼睛完成位移。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，牙鲆和半滑舌鰨()皮膚的RA濃度在有眼側(cè)皮膚高于無眼側(cè)皮膚，且光照可通過RA/RAR信號(hào)通路誘導(dǎo)牙鲆無眼側(cè)色素過度沉著(黑化)，表明RA/RAR信號(hào)通路在半滑舌鰨、牙鲆的體色左右不對(duì)稱發(fā)育模式中起重要調(diào)控功能(Shao, 2017)，但RA/RAR系統(tǒng)對(duì)半滑舌鰨體色調(diào)控的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

半滑舌鰨屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，為我國近海自然分布的重要經(jīng)濟(jì)魚類，自人工繁育技術(shù)取得突破以來，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展，已成為鲆鰈類三大主導(dǎo)養(yǎng)殖品種之一(鄧景耀等, 1988; 柳學(xué)周等, 2006、2014)。養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨無眼側(cè)黑化(色素沉積過多)問題日益凸顯，而無眼側(cè)發(fā)生黑化的商品魚市場價(jià)格較無眼側(cè)正常魚價(jià)格低20%以上，成為制約半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的瓶頸之一。目前，國內(nèi)外對(duì)半滑舌鰨無眼側(cè)黑化發(fā)生的相關(guān)機(jī)制鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室前期研究了半滑舌鰨體色相關(guān)功能基因POMC、MCHR與MCH等的克隆、表達(dá)調(diào)控及其與體色的關(guān)系(史學(xué)營等, 2015、2017; 朱學(xué)武等, 2016; 徐永江等, 2017)，為認(rèn)識(shí)半滑舌鰨無眼側(cè)體色調(diào)控機(jī)制積累了資料。本研究擬開展半滑舌鰨RAR結(jié)構(gòu)及其表達(dá)特性研究，以期為探究RA/RAR系統(tǒng)在養(yǎng)殖半滑舌鰨無眼側(cè)黑化調(diào)控中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚及樣品處理

實(shí)驗(yàn)用半滑舌鰨于2017年6~8月取自山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司。取樣實(shí)驗(yàn)魚3尾(都存在一定程度無眼側(cè)黑化)，體長為(33±3) cm，體重為(237±30) g，用于RAR基因克隆與組織表達(dá)特性分析。實(shí)驗(yàn)魚以MS-222 (280 mg/L)麻醉后，快速取性腺、肝臟、心臟、胃、腸、脾、腎、垂體、腦、鰓、肌肉、有眼側(cè)正常皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)正常皮膚組織投入液氮速凍后，轉(zhuǎn)入–80℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA提取和cDNA第1鏈合成

利用RNAiso Plus (TaKaRa，日本)試劑盒并按照操作說明提取各組織樣品總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，NanoDrop 2000 (Thermo，美國)測定RNA濃度。取適量鰓組織總RNA，以PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)合成cDNA第1鏈。以SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國)合成5￠-RACE及3￠-RACE cDNA第1鏈，用于RAR基因RACE全長克隆。取等量各組織樣品的總RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)合成cDNA第1鏈，用于RAR mRNA組織表達(dá)特性及分析。各操作步驟均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。

1.3 總RNA提取和中間片段擴(kuò)增

根據(jù)GenBank登記的XM_017034299.1、XM_ 008318896.2預(yù)測半滑舌鰨RARs序列保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物(表1)，以肝臟組織為模板，擴(kuò)增RARα基因的核心序列，PCR反應(yīng)體系(25 μl)：0.2 μl酶、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl dNTP Mixture、0.5 μl模板、1 μl RARα-F、1 μl RARα-R、17.8 μl ddH2O。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，38個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增RARγ基因的模板為脾臟，PCR反應(yīng)體系和條件同RARα；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的條帶并純化?；厥誔CR產(chǎn)物與pEASY-T1載體(北京全式金生物公司)連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金)，LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序；RAR的中間序列已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(RARα登錄號(hào)：MG596268；RARγ登錄號(hào)：MG596269)。

表1 半滑舌鰨RAR基因克隆使用的PCR擴(kuò)增引物

Tab.1 Primers used for PCR amplification of RAR of C. semilaevis

1.4 RAR的RACE擴(kuò)增

根據(jù)克隆驗(yàn)證的中心片段設(shè)計(jì)RACE引物。用Smart RACE Advantage 2 PCR試劑盒(Clontech，美國)進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。第1次PCR，反應(yīng)體系：17 μl ddH2O、2.5 μl Buffer、2 μl 50×dNTP Mix、0.5 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix、1 μl cDNA、引物RARα1 1 μl和1 μl UPM，共計(jì)25 μl。設(shè)計(jì)Touchdown PCR，反應(yīng)條件為94℃ 30 s，66℃30 s，72℃ 2 min，15個(gè)循環(huán)，T值每5個(gè)循環(huán)降低2℃；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，20個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以第1次PCR產(chǎn)物稀釋10倍為模板，進(jìn)行巢式PCR，反應(yīng)體系：17 μl ddH2O、2.5 μl Buffer、2 μl 50×dNTP Mix、0.5 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix、1 μl cDNA、1 μl NPM和1 μl RARα2引物，共計(jì)25 μl。PCR反應(yīng)條件同第1次PCR。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆并測序。RARγ反應(yīng)體系與條件同RARα。

1.5 RAR mRNA定量表達(dá)分析

根據(jù)獲得的半滑舌鰨RARα和RARγ的cDNA序列設(shè)計(jì)定量PCR引物qRARα和qRARγ(表1)，以18S為內(nèi)參。利用Mastercycler ep realplexreal-time PCR儀(Eppendorf，德國)，使用SYBR Premix ExTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行定量擴(kuò)增，PCR體系(20 μl)：1 μl cDNA模板、上下游引物各0.8μl (10 μmol/L)、10μl SYBR Premix ExTMⅡ和7.4 μl dd H2O.。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，58℃20 s、共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品測試設(shè)置3個(gè)重復(fù)。RAR mRNA的表達(dá)量以18S mRNA表達(dá)量為基礎(chǔ)，利用2-DD方法計(jì)算獲得(Livak, 2001)。

1.6 序列分析及數(shù)據(jù)處理

半滑舌鰨RAR基因的結(jié)構(gòu)、分子量預(yù)測、等電點(diǎn)預(yù)測使用ExPASy在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(www.expasy. org/tools/protparam.html)；氨基酸序列推導(dǎo)、序列拼接和氨基酸同源性分析均使用軟件DNAMAN 6.0，信號(hào)肽預(yù)測使用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。亞細(xì)胞定位使用PSORT Ⅱ軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)，氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析使用ClustalW在線軟件(http://www.genome.jp/tools-bin/ clustalw)和MEGA 7軟件。通過SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL在線軟件(http://www.swi-ssmodel.expasy.org/)分析預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)、Duncan和SNK多重比較分析，當(dāng)<0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 RAR cDNA序列結(jié)構(gòu)

半滑舌鰨RARα cDNA序列全長為1823 bp (圖1)，包括17 bp的5￠非編碼區(qū)(UTR)、1332 bp的開放閱讀框(ORF)和474 bp的3￠非編碼區(qū)(UTR)，編碼443個(gè)氨基酸，預(yù)測編碼蛋白分子量為49 kb，等電點(diǎn)為8.47。半滑舌鰨RARγ cDNA序列全長為1959 bp (圖2)，包括305 bp的5￠(UTR)、1497 bp的ORF和98 bp的3￠(UTR)，編碼498個(gè)氨基酸，預(yù)測編碼蛋白的分子量為55.8 kb，等電點(diǎn)為4.99。預(yù)測2種RAR基因的亞細(xì)胞定位均位于細(xì)胞核。

2.2 RAR編碼蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA軟件分析RAR編碼蛋白的空間二級(jí)結(jié)構(gòu)：在RARα成熟蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占34.31%，β-轉(zhuǎn)角占8.35%，無規(guī)則卷曲占43.12%，延伸鏈占14.22%。在RARγ成熟蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占36.75%，β-轉(zhuǎn)角占9.44%，無規(guī)則卷曲占40.36%，延伸鏈占13.45%。通過SWISS-MODEL網(wǎng)站同源建模方法構(gòu)建了半滑舌鰨RAR編碼的蛋白質(zhì)可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以同源建模的方法與各自的50個(gè)RA核受體家族模板構(gòu)建預(yù)測可能的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，RARα獲得6種三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，選取GMQE評(píng)價(jià)值0.55、QMEAN穩(wěn)定系數(shù)-2.79(負(fù)值越大越穩(wěn)定)構(gòu)建模型；RARγ有5種，選取GMQE評(píng)價(jià)值0.61，QMEAN穩(wěn)定系數(shù)-2.13構(gòu)建模型。三級(jí)結(jié)構(gòu)模型顯示(圖3)，RAR蛋白質(zhì)分為3部分，藍(lán)色的DBD區(qū)和LBD區(qū)通過橘黃色的D區(qū)鉸鏈區(qū)相連。

2.3 RAR的氨基酸序列同源性比較

同源性分析顯示，半滑舌鰨RARα的氨基酸序列與同屬鰈形目的牙鲆的同源性最高，為97.0%，其次為銀大麻哈魚()92.2%、鱸魚() 87.9%、斑馬魚()86.8%、紅鰭東方鲀()64.6%，且與兩棲類、爬行類、嚙齒類、鳥類和人()的相似度分別為79.6%、82.2%、80.5%、81.5%和80.7%。半滑舌鰨RARγ的氨基酸序列同樣與牙鲆同源性最高，達(dá)97%，與其他魚類的同源性均達(dá)90.5%以上，與兩棲類、嚙齒類和人的相似度分別為71.4%、84.5%和80.7%。另外，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸序列相似度為60.8% (表2)。

通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨與鱸魚、人、斑馬魚具有相似的功能結(jié)構(gòu)域，都具有DNA結(jié)合區(qū)(DBD區(qū))和配體結(jié)合區(qū)(LBD)區(qū)。利用ClustalW對(duì)半滑舌鰨RAR的氨基酸序列與其他物種的RAR氨基酸序列進(jìn)行了比較(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨與其他魚類RAR的氨基酸序列整體保守性較強(qiáng)，除在N端的A/B區(qū)和C端的F區(qū)末尾保守型較差外，中間的DNA與配體結(jié)合區(qū)保守度較高。

2.4 RARs系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用NJ法構(gòu)建了基于氨基酸序列的半滑舌鰨RARα、RARγ和其他脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，半滑舌鰨RARα和RARγ都分別與鰈形目、鱸形目、鯉形目等其他魚類形成獨(dú)立的分支，而兩棲類、哺乳類和爬行類形成獨(dú)立的分支。

2.5 RARmRNA的組織表達(dá)特性

半滑舌鰨2種RAR基因在所有檢測組織中都有表達(dá)。RARα mRNA在腎臟和眼中表達(dá)量最高，與除胃的其他組織差異顯著，在胃中的表達(dá)也較高，在腦、脾臟、鰓、無眼側(cè)白皮膚、性腺、有眼側(cè)肌肉、腸、心臟、無眼側(cè)黑化皮膚、無眼側(cè)肌肉、有眼側(cè)皮膚等其他組織中也檢測到一定的表達(dá)量。半滑舌鰨RARγmRNA在脾臟和鰓中表達(dá)量最高，在心臟和腎臟表達(dá)量也較高，與其他組織差異顯著；而在無眼側(cè)白皮膚、腦、眼、胃、性腺、無眼側(cè)黑化皮膚、無眼側(cè)肌肉、垂體等其他組織表達(dá)量相對(duì)較低。在腎臟中，2種RAR mRNA表達(dá)水平都很高。脾臟、心臟、鰓、腎臟、無眼側(cè)白皮膚等組織中RARγmRNA表達(dá)量高于RARα，而在眼、胃、腸、性腺、肌肉、肝臟、有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚等組織中，RARα mRNA表達(dá)量高于RARγ，脾臟、心臟、鰓和腎臟組織中RARγ與RARα表達(dá)差異顯著，而其他組織中RARγ與RARα表達(dá)差異不顯著。腦中2種RAR mRNA表達(dá)量基本一致，表明這2種RAR基因在不同組織中的生理功能可能存在差異，即使在同一組織中其生理功能也多存在一定的差異(圖6)。

圖1 半滑舌鰨RARα基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

推導(dǎo)的氨基酸序列用單字母表示，從陰影顯示的起始甲硫氨酸開始計(jì)數(shù)。終止密碼子用*表示。下同

The deduced amino acid residues were represented as single letter abbreviations and numbered from the initiating methionine which was shadowed. Termination codon was marked with *. The same as below

圖2 半滑舌鰨RARγ基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 SWISS-MODEL預(yù)測的半滑舌鰨RARα(左)和RARγ(右)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

分析有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)白皮膚中2種RAR基因mRNA的表達(dá)情況(圖7)，發(fā)現(xiàn)無眼側(cè)白皮膚的2種RAR mRNA的表達(dá)量最高，其次為無眼側(cè)黑化皮膚，最低的為有眼側(cè)皮膚，其中，RARγ表達(dá)差異顯著。RARγ在無眼側(cè)未黑化皮膚中的表達(dá)顯著高于RARα (<0.05)，而在正常有眼側(cè)皮膚和無眼側(cè)黑化皮膚中，RARα的表達(dá)高于RARγ，表明可能RARα和RARγ對(duì)皮膚組織中色素的調(diào)控作用具有不同的調(diào)控機(jī)制。

3 討論

本研究獲得了半滑舌鰨RAR的2個(gè)亞型RARα和RARγcDNA序列全長，并研究了其組織表達(dá)特性，為研究RA/RAR系統(tǒng)對(duì)體色異常調(diào)控提供了基礎(chǔ)材料。本研究獲得了半滑舌鰨2個(gè)RAR亞型的結(jié)構(gòu)，預(yù)測未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽(Napoli, 1996)。同其他脊椎動(dòng)物一致，半滑舌鰨RAR具備A~F共6個(gè)功能域，在進(jìn)化過程中高度保守，其中，C區(qū)最為保守，具有鋅指結(jié)構(gòu)功能的為DBD區(qū)。E區(qū)在配體結(jié)合中起輔助作用，形成疏水氨基酸殘基。D區(qū)作為鉸鏈連接DBD和LBD (Leid, 1992)。同源性分析表明，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸序列與牙鲆的同源性最高，達(dá)97%，與其他魚類、兩棲類、爬行類、嚙齒類和人的氨基酸同源性也處于較高水平，表明其在進(jìn)化過程中保守性較強(qiáng)。同時(shí)，本研究顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸同源性達(dá)60.8%，但在進(jìn)化樹上屬于2個(gè)不同的進(jìn)化分支，表明在進(jìn)化過程中2種RAR受體基因出現(xiàn)了進(jìn)化差異。

表2 半滑舌鰨RAR氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的同源性比較

Tab.2 Comparison of homology of the precursor peptide sequences of RAR gene between C. semilaevis and other vertebrates

圖4 半滑舌鰨與其他物種的RAR氨基酸序列比較

“*”表示一致的氨基酸；“:”表示高度保守度的氨基酸；“.”表示低保守度的氨基酸；陰影部分表示DBD和 LBD功能結(jié)構(gòu)域；RAR氨基酸序列號(hào)見表2；CS：半滑舌鰨；DR：斑馬魚LJ：鱸魚；HS：人

Asterisks (*) indicated identical amino acid sequences; Dot (:) indicated highly conserved amino acid sequences; Dot (.) indicatedamino acid sequences of low degree conserved; GenBank accession numbers were shown in Tab.2. The shadow part represents the DBD and LBD functional domains CS:;DR:; LJ:;HS:

圖5 基于RAR氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 半滑舌鰨RAR mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

BR：腦；EYE：眼；GI：鰓；H：心臟；L：肝臟；SP：脾臟；K：腎臟；ST：胃；I：腸；GO：性腺；EM：有眼側(cè)肌肉；BM：無眼側(cè)肌肉；ES：有眼側(cè)皮膚；BHS：無眼側(cè)黑化皮膚；BWS：無眼側(cè)白皮膚；P：垂體。不同組織表達(dá)差異分析中Y和y字母代表單獨(dú)分析RARγ的2個(gè)顯著差異集合，RARα單獨(dú)分析使用a、b、c，代表3個(gè)顯著差異集合，同一組織2種基因表達(dá)顯著差異(<0.05)用大括號(hào)表示，下同

B: Brain; EYE: Eye; GI: Gill; H: Heart; L: Liver; SP: Spleen; K: Kindey; ST: Stomach; I: Intestine; GO: Gonad; EM: Eye-side muscle; BM: Blind-side muscle; ES: Eye-side skin; BHS: Blind-side hypermelanosis skin; BWS: Blind-side white skin; P: Pituitary. In different tissue expression analysis, Y and y letters represent two distinct different sets of RARγ analysis separately, RARα analysis alone, a, b and c represent three significant different sets. The significant difference in the expression of two genes in the same tissue is expressed in braces (<0.05), the same as below

圖7 半滑舌鰨RAR mRNA在皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量

ES：有眼側(cè)皮膚；BHS：無眼側(cè)黑化皮膚；BWS：無眼側(cè)白皮膚

ES: Eye-side skin; BHS: Blind-side hypermelanosis skin; BWS: Blind-side white skin

本研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨2種RAR基因mRNA在所有檢測組織中均有表達(dá)，表明其均具有廣泛的生理作用。RARα mRNA在腎臟中表達(dá)量最高，表明腎臟可能為其主要靶器官，而同時(shí)在眼、腦和胃中的表達(dá)量高于其他組織，表明RARα在這些組織器官的生理功能中都可能起重要的調(diào)控作用，這種組織表達(dá)分布特征與斑馬魚(Joore, 1994)、鱸魚(錢云霞等, 2012)以及哺乳動(dòng)物(Meng, 2011) RARα的組織表達(dá)特性相似。另外，半滑舌鰨RARγmRNA的主要靶器官為脾臟和鰓，同時(shí)，在心臟和腎臟中均有高表達(dá)量，表明RARγ主要在這些器官中起重要的表達(dá)調(diào)控作用。2種RAR受體mRNA都在腎臟中具有高表達(dá)，推測腎臟可能是RA/RAR信號(hào)通路的重要作用靶點(diǎn)，具體作用方式有待于下一步深入研究。對(duì)虹鱒()的研究結(jié)果表明，鰓是RAR的主要表達(dá)器官，推測與其較高的新陳代謝速率有關(guān)，也可能與RAR調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與凋亡功能相關(guān)(Alsop, 2001)。本研究也發(fā)現(xiàn)，鰓中2種RAR受體基因的表達(dá)量較高，但其具體的生理功能有待于進(jìn)一步研究。在對(duì)雞()的RARγ研究中，發(fā)現(xiàn)雞與哺乳動(dòng)物有相似的表達(dá)特異性，即RARγ表達(dá)高度限制在皮膚中(Michaille, 1994)，然而，半滑舌鰨RAR表達(dá)在皮膚和肌肉相對(duì)其他組織較少，這種組織分布的差異主要可能是由種的差異引起的。

本研究中，比較了有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)白皮膚和無眼側(cè)黑化皮膚中2種RAR基因mRNA的表達(dá)情況和兩者的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在正常有眼側(cè)皮膚中和在無眼側(cè)黑化皮膚中RARα的表達(dá)略高于RARγ，而在無眼側(cè)未發(fā)生黑化的皮膚中，RARγ的表達(dá)卻顯著高于RARα。先前對(duì)半滑舌鰨色素細(xì)胞的研究表明，黑色素與虹彩細(xì)胞等的數(shù)量分布以有眼側(cè)皮膚中最多，無眼側(cè)黑化皮膚中其次，而無眼側(cè)白皮膚中無黑色素細(xì)胞分布(史學(xué)營等, 2015)。這種不同狀態(tài)的皮膚組織中RAR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)與黑色素細(xì)胞分布的關(guān)系表明，RARγ與RARα均參與了半滑舌鰨皮膚組織中黑色素細(xì)胞的生長發(fā)育與分布調(diào)控過程，但其在皮膚組織中黑色素細(xì)胞的形成方面具有差異表達(dá)調(diào)控作用。與RARγ相比，RARα與皮膚中黑色素細(xì)胞的生長及數(shù)量分布調(diào)控可能具有更為密切的關(guān)系。今后應(yīng)結(jié)合鲆鰈類黑色素相關(guān)基因(如MCH、MCHR、POMC等)的表達(dá)和作用機(jī)理進(jìn)行深入研究，探討它們之間的相互作用關(guān)系。

在牙鲆研究中，RARs與配體ATRA結(jié)合作用于苗種骨骼變態(tài)和體色沉著(Haga, 2003)。Shao等(2017)通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，牙鲆和半滑舌鰨有眼側(cè)皮膚ATRA和9-cis-RA濃度均高于無眼側(cè)皮膚，但兩側(cè)皮膚中RAR和RXR的基因表達(dá)沒有明顯差異。本研究未能測定不同類型皮膚中的RAR配體濃度，是否是配體濃度梯度的差異導(dǎo)致受體基因表達(dá)量的差異有待于今后深入研究。結(jié)合本研究RAR在皮膚中的分布，推測半滑舌鰨RAR可能與黑色素細(xì)胞的發(fā)育及分布具有不同的關(guān)系。已有研究證明，在斑馬魚中存在RARα-a和RARα-b亞型(Hale, 1993)，而半滑舌鰨基因組預(yù)測其具有RARα、RARβ和RARγ三種亞型，同時(shí)，每一種亞型又有數(shù)種不同的分子形式(Chen, 2014)，開展RAR基因在不同組織器官中的表達(dá)特征和可能的生理功能研究有助于闡明RA/RAR系統(tǒng)在無眼側(cè)黑化發(fā)生的機(jī)理。本研究中，還發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨RARα和RARγ mRNA在腎臟、脾臟、腦、眼、胃、無眼側(cè)白皮膚、性腺等組織中同時(shí)具有高表達(dá)，且在不同的組織中2種受體基因表達(dá)量不同，表明半滑舌鰨2種RAR基因在不同的組織中生理功能不同。Shao等(2017)在成年牙鲆兩側(cè)皮膚中發(fā)現(xiàn)，感光視蛋白對(duì)光照刺激有應(yīng)答反應(yīng)，在光刺激下會(huì)影響配體RA在體兩側(cè)的濃度差，作用于RA/RAR系統(tǒng)導(dǎo)致無眼側(cè)發(fā)生黑化。工廠化養(yǎng)殖環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，幼魚通過補(bǔ)充RAR的配體RA控制了鲆鰈類有眼側(cè)無黑色素沉著現(xiàn)象(白化)，而過量的RA補(bǔ)充卻會(huì)導(dǎo)致無眼側(cè)黑色素沉著過多(黑化)(Miwa, 1999)。研究發(fā)現(xiàn)，改變光照(Shao, 2017)、鋪沙(Estevez, 2001)、棲息環(huán)境顏色(Takahashi, 2004)和養(yǎng)殖密度(Bolker, 2000)等也會(huì)影響無眼側(cè)黑色素沉著，且這些外源刺激都與攝食RA或通過眼和皮膚的感光視蛋白接收刺激產(chǎn)生RA，從而調(diào)控RAR表達(dá)，并最終作用于鲆鰈類的體色沉著有一定關(guān)系。Isojima等(2014)研究表明，鲆鰈類體色發(fā)生與分布受到多種基因表達(dá)調(diào)控。深入開展RA/RAR系統(tǒng)對(duì)體色的調(diào)控作用及其信號(hào)通路的系統(tǒng)研究將有助于揭示半滑舌鰨無眼側(cè)黑化的分子調(diào)控機(jī)制。

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Molecular Cloning and Spatial Expression of Two Retinoic Acid Receptors RARalpha and RARgammafrom

SONG Xuesong1,2, XU Yongjiang1, LIU Xuezhou1①, SHI Bao1, WANG Bin1, LIU Yongshan1,2, ZHANG Yaxing1,2

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Two retinoic acid receptors, RARalpha and RARgamma, were cloned fromusing RT-PCR and RACE methods, and their spatial expression patterns were investigated using a quantitative PCR assay. The results showed thatfull-length cDNA sequence encoding the RARalpha gene is 1823 bp in length, its open reading frame (ORF) length is 1332 bp, encoding 443 amino acids; the RARgamma cDNA sequence is 1959 bp in length, and the length of ORF is 1497 bp, encoding 489 amino acids. Homology analysis showed thatRARalpha and RARgamma have homology identity of 60.8%, and both have 97% homology identity with the Japanese flounder. Phylogenetic analysis showed thatRARalpha and RARgamma clustered into a separate branch with other fish counterparts. Spatial expression analysis showed that the highest expression level of RARalpha mRNA occurred in the kidney, whereas the highest expression level of RARgamma mRNA was in the spleen. RARgamma was also highly expressed in the gill, kidney, and heart. Furthermore, RARalpha and RARgamma mRNA expression were detected in all examined tissues, which indicated that these two retinoic acid receptors were both involved in multiple physiological regulation processes. In addition, the differential expression of these two RAR genes were found in the blind side and ocular skins, wherein they both had highest expression levels in the normal blind side skin, followed by the blacking blind side skin and had the lowest expression levels in the ocular side skin. In ocular skin and blind-side blacking skin, the RARalpha expression levels were higher than RARgamma but without significant difference, wherein in blind-side normal skin, the RARgamma expressed significantly higher than RARalpha. This differential expression pattern indicated that they might play important physiological roles in blind-side hypermelanosis regulation of.

; Retinoic acid receptor; Gene cloning; Expression pattern; Hyperpigmentation

LIU Xuezhou, E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

宋雪松, 徐永江, 柳學(xué)周, 史寶, 王濱, 劉永山, 張雅星. 半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達(dá)特性. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(6): 52–64

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* 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2017GH05; 2017GH17)、國家海水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)、國家自然科學(xué)基金(31502145; 31602133)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(20603022017016)共同資助 [This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (CAFS) (2017GH05; 2017GH17), China Agricultural Research System (CARS-47), National Natural Science Foundation of China (31502145; 31602133), and Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022017016)]. 宋雪松，E-mail: 746284973@qq.com

柳學(xué)周，研究員，E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

2017-12-20,

2018-01-29

10.19663/j.issn2095-9869.20171220003

TS201.4；S917.4

A

2095-9869(2018)06-0052-13

(編輯 馮小花)