朱艷霞, 黃燕芬, 柯 芳
(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室,廣西南寧 530023)
滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)的干燥根莖是我國傳統(tǒng)名貴中藥材重樓的基源之一,具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效[1]。近年來,由于人們掠奪式采挖,其野生資源瀕臨滅絕,已被列為國家二級瀕危藥用植物和云南省稀缺瀕危天然藥物[2-4]。滇重樓種子成熟時胚發(fā)育不完整[5],外種皮和種子中存在種子萌發(fā)抑制物[6-8],內(nèi)源脫落酸含量高[9]等是造成其種子休眠的主要原因,去除種皮[10]、變溫層積[11]、超聲波處理[12]、濕沙層積協(xié)同赤霉素處理[13]、低溫層積協(xié)同紅外光照射[14]等處理均能解除種子休眠狀態(tài),發(fā)芽適宜的溫度是18~20 ℃,適宜的光照是750~1 500 lx的弱光,適宜的發(fā)芽床是沙[15-17]。隨著滇重樓種子萌發(fā)機制的深入研究,野生變家種技術也成功突破,目前云南、四川、貴州、廣西、湖南等地均有成功引種栽培滇重樓的報道。隨著滇重樓栽培區(qū)域的不斷擴大,引進地生態(tài)環(huán)境與原生地環(huán)境差異越來越大,但對滇重樓種子的研究主要集中于休眠機理和休眠解除方法,尚未見種子質(zhì)量的產(chǎn)地變異研究。本試驗收集20個滇重樓種植基地的成熟種子,測定種子形態(tài)和發(fā)芽率,進行聚類分析,揭示產(chǎn)地與種子質(zhì)量的關系,以期為滇重樓人工栽培過程中種子質(zhì)量評價、種源質(zhì)量的產(chǎn)地劃分和確定優(yōu)良種源的引種地提供理論依據(jù)。
供試滇重樓種子2016年10月采自云南、貴州、廣西等地,將新鮮果實采收后用清水搓洗除去果皮和假種皮得凈種子,測定種長、種寬和千粒質(zhì)量。凈種子分成2份,1份直接做發(fā)芽試驗,1份低溫層積3個月后再測發(fā)芽率。低溫層積方法是將凈種子與濕珍珠巖按體積比為1 ∶3混合均勻,置于4 ℃恒溫恒濕條件下保存3個月。
1.2.1 種長和種寬測定 隨機選取凈種子20粒,用電子游標卡尺測定種子縱軸最長處的長度為種長,種子橫軸最短處的長度為種寬,取平均值。
1.2.2 千粒質(zhì)量測定 隨機選取凈種子1 000粒,用電子天平測定質(zhì)量,4次重復,取平均值。
1.2.3 發(fā)芽率測定 隨機選取種子100粒,清水沖洗干凈,再擺放至內(nèi)鋪3 cm厚濕潤珍珠巖的發(fā)芽盒內(nèi),發(fā)芽盒置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),以15、20、25 ℃恒溫或15 ℃/25 ℃變溫,12 h光—12 h暗的交替光照條件培養(yǎng),每隔15 d補水保持珍珠巖濕潤,置床后每隔30 d檢查種子發(fā)芽率,胚根突破種皮2 mm視為萌發(fā),4次重復。
使用Microsoft Excel 2007對數(shù)據(jù)進行記錄整理,SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
從表1的結(jié)果可見,20份滇重樓種子的平均長度、寬度、千粒質(zhì)量分別為6.373 mm、4.271 mm、44.54 g。種長最小的是S3,最大的是S12,分別為5.964 mm和7.160 mm。種寬最小的是S14,最大的是S12,分別為4.036 mm和4.648 mm。千粒質(zhì)量最小的是S1,最大的是S5,分別為34.35 g和51.36 g。由表2的相關性分析結(jié)果可知,種長與千粒質(zhì)量顯著相關,種寬與千粒質(zhì)量極顯著相關。
表1 滇重樓種子大小和質(zhì)量
注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母代表0.05水平差異顯著。下同。
表2 種子形態(tài)的相關性分析
注:“**”表示在0.01水平上(雙尾)相關性顯著,“*”表示在0.05水平上(雙尾)相關性顯著。
新鮮種子直接點播于珍珠巖發(fā)芽床,25 ℃恒溫條件下測得的發(fā)芽率結(jié)果見表3。由表3可知,滇重樓新鮮種子培養(yǎng)5個月未見種子萌發(fā);第6個月發(fā)芽率為2.2%,其中S1發(fā)芽率最高,為4.5%,與S3、S5、S6無顯著差異,但顯著高于其他16個采集地的種子(P<0.05);第7個月發(fā)芽率提高至5.2%,其中S2發(fā)芽率最高,為7.5%,顯著高于S14、S18(P<0.05),但與其他17個采集地的無顯著差異;第8個月發(fā)芽率增至11.4%,其中S10發(fā)芽率最高,為16.0%,S8發(fā)芽率最低,僅為9.5%,顯著低于S5、S10、S13號(P<0.05),但與其他16個采集的種子無顯著差異。結(jié)果說明,未低溫層積處理的新鮮種子發(fā)芽率較低,發(fā)芽時間長,20份種子中除發(fā)芽率較低的S8和發(fā)芽率較高的S5、S10、S13外,其他多數(shù)種子的發(fā)芽率無顯著差異。
表3 滇重樓新鮮種子發(fā)芽率
4 ℃恒溫恒濕條件下層積3個月的滇重樓種子,在25、20、15 ℃恒溫和15 ℃/25 ℃變溫條件下的發(fā)芽率結(jié)果見表4。
發(fā)芽培養(yǎng)溫度為25 ℃恒溫時:第2個月發(fā)芽率均值 3.9%,其中S2發(fā)芽率最高,S13最低;第3個月S2發(fā)芽率最高,為25.3%,顯著高于S1、S3、S4、S5(P<0.05),與其他15個采集地無顯著差異;第4個月S9發(fā)芽率最高,為52.5%,顯著高于S2(P<0.05),與其他18個采集地無顯著差異;第5個月發(fā)芽率最高和最低的分別是S20和S6,分別為 62.0% 和55.3%,20個采集地之間無顯著差異。
發(fā)芽培養(yǎng)溫度為20 ℃恒溫時:第2個月發(fā)芽率均值 4.4%;第3個月發(fā)芽率升至22.7%,20個采集地之間無顯著差異;第4個月S20發(fā)芽率最高,為54.0%,顯著高于S4、S7、S9、S11、S12、S13、S14、S19(P<0.05),與其他11個采集地無顯著差異;第5個月S17發(fā)芽率最高,為65.8%,顯著高于S3、S4、S6(P<0.05),與其他16個采集物無顯著差異,S3發(fā)芽率最低,為59.0%,顯著低于S17和S19(P<0.05),與其他17個采集地之間無顯著差異。
發(fā)芽培養(yǎng)溫度為15 ℃恒溫時:第2個月發(fā)芽率均值僅為1.9%;第3個月S12發(fā)芽率最高,為15.0%,顯著高于S1、S3、S4、S5、S10、S11、S16(P<0.05);第4個月發(fā)芽率均值升至 23.7%,20個采集地之間無顯著差;第5個月20個采集地之間無顯著差異。
表4 滇重樓層積種子發(fā)芽率 %
發(fā)芽培養(yǎng)溫度為15 ℃/25 ℃變溫時:第2個月發(fā)芽率為3.5%;第3個月發(fā)芽率迅速上升至31.9%,其中S2發(fā)芽率最高,為35.5%,顯著高于S5、S13、S14、S18(P<0.05),與其他15個采集地無顯著差異;第4個月S12發(fā)芽率最高,為 68.8%,顯著高于S6號(P<0.05),與其他18個采集地無顯著差異;第5個月S18發(fā)芽率最高,達73.0%,顯著高于S13、S20(P<0.05),與其他17個采集地無顯著差異,S20發(fā)芽率最低,為67.0%,顯著低于S18(P<0.05),與其他18個采集地無顯著差異。
低溫層積種子在不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽率差異性分析結(jié)果見表5,置床后150 d,15 ℃/25 ℃變溫條件下發(fā)芽率顯著高于20、25、15 ℃恒溫(P<0.05)。結(jié)果說明,低溫層積處理后種子發(fā)芽率提高,較為適宜的發(fā)芽培養(yǎng)溫度條件是15 ℃/25 ℃變溫。
表5 滇重樓層積種子在不同溫度下的發(fā)芽率差異性分析 %
以千粒質(zhì)量、低溫層積種子在15 ℃/25 ℃變溫培養(yǎng)5個月的發(fā)芽率進行組內(nèi)聯(lián)接的平方歐氏距離聚類分析,結(jié)果見圖1。按滇重樓的產(chǎn)地來源可將其種子劃分為3類,第1類包括S1、S2、S3、S6、S7、S14、S17和S20,這8個產(chǎn)地滇重樓特點是種子粒徑小、質(zhì)量小、發(fā)芽率較低;第2類包括S4、S5、S9、S11、S12、S13、S16,這7個產(chǎn)地滇重樓特點是種子粒徑大、千粒質(zhì)量大、發(fā)芽率處于中等水平;第3類包括S8、S10、S15、S18和S19,這5個產(chǎn)地特點是種子中等大小、種子發(fā)芽率較高。
我國有重樓屬植物19種18變種,其中滇重樓和七葉一枝花分布較廣,分布區(qū)域包括云南、四川、貴州、湖北、甘肅等地[18],本研究中20份種子的產(chǎn)地分別為云南、貴州、廣西,均是滇重樓主產(chǎn)區(qū)。由于各產(chǎn)地間的溫度、光照、降水量、土壤條件等環(huán)境條件各不相同,為適應不同的環(huán)境條件,植物可能產(chǎn)生一些遺傳變異,并將穩(wěn)定的遺傳變異反映在種子品質(zhì)上[19]。對藥用植物來說,種子質(zhì)量是實現(xiàn)藥材高產(chǎn)高效栽培的基礎,更是保證藥材藥效品質(zhì)純正穩(wěn)定的源頭。因此,研究不同產(chǎn)地的種子質(zhì)量差異對研究不同產(chǎn)地環(huán)境下藥用植物品質(zhì)評價具有重要意義,也對優(yōu)良種質(zhì)篩選和高產(chǎn)高效栽培過程中種源產(chǎn)地劃分和引種地的選擇具有指導意義。
我國農(nóng)作物種子質(zhì)量評價體系常用的指標是純度、凈度、水分和發(fā)芽率[20-22],本研究首先測定了新鮮滇重樓種子的形態(tài),包括種長、種寬和千粒質(zhì)量,發(fā)現(xiàn)種子大小和質(zhì)量呈顯著的正相關關系。然后對滇重樓種子發(fā)芽特性進行研究,發(fā)現(xiàn)新鮮種子在第5個月時仍未見發(fā)芽,8個月平均發(fā)芽率僅11.4%,低溫層積種子發(fā)芽率顯著提高,發(fā)芽時間縮短,尤其是發(fā)芽溫度為15 ℃/25 ℃變溫時,5個月的平均發(fā)芽率為69.8%。根據(jù)以上結(jié)果,在種長、種寬、千粒質(zhì)量等3個顯著性相關的指標中選取千粒質(zhì)量,選取層積種子15 ℃/25 ℃發(fā)芽率,作為評價滇重樓種子質(zhì)量的主要指標。綜合千粒質(zhì)量和發(fā)芽率指標聚類分析,可將20個產(chǎn)地的滇重樓種子劃分為3類,第1類來源于貴州六盤水和云南文山,特點是種子小、發(fā)芽率低;第2類主要來源于廣西百色、云南文山,特點是種子大、發(fā)芽率中等水平;第3類來源于包括云南西北部和中部,特點是種子中等大小、種子發(fā)芽率偏高。
本研究僅從種子外觀大小、千粒質(zhì)量、發(fā)芽率上做了分析,在種子內(nèi)部解剖結(jié)構、貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)成分和含量以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和基因組等方面的差異有待以后進一步研究。