陳踴南，葉日英，陳俏純，陳慧珍，羅敏敏，陳欣

(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088)

腌魚由于具有獨(dú)特的風(fēng)味而倍受人們青睞，且加工方法簡單、成本低廉，在魚類加工業(yè)中占有較大比重，是遠(yuǎn)洋捕撈及個體較小的魚多采用的加工方式。魚在腌制過程中，部分蛋白質(zhì)被分解為游離氨基酸，細(xì)菌使其產(chǎn)生脫羧反應(yīng)生成生物胺。組胺是組氨酸脫羧基反應(yīng)生成的無色無味、不揮發(fā)的有機(jī)胺，具有毒性，食用組胺含量較高的腌魚會使人出現(xiàn)急性中毒癥狀或引起慢性病變，曾出現(xiàn)多起由人食用腌魚而產(chǎn)生的組胺中毒事故。國際糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)于2012年7月23—27日在羅馬召開專家會議，討論魚和魚產(chǎn)品中組胺和其他生物胺引發(fā)的公共健康風(fēng)險(xiǎn)問題，確定組胺的無明顯損害作用水平值(NOAEL)為50 mg。由于金線魚腌制品較多，本研究選用金線魚作為原料進(jìn)行腌制試驗(yàn)，在不同的時間點(diǎn)取樣檢測組胺含量。細(xì)菌是形成組胺的重要因素，因此在成品腌魚中分離出產(chǎn)組胺細(xì)菌，并對其進(jìn)行產(chǎn)組胺能力檢測和菌屬鑒定，以便今后采取有效措施抑制產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長，控制腌制魚的組胺含量。

1 材料與方法

1.1 材料

冰鮮金線魚和食鹽均購于湛江市超市。

磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、D-組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、L-組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)均購于南京奧多福尼生物科技有限公司；其余試劑購于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

TD5臺式多管架低速離心機(jī)，長沙英泰儀器有限公司；G1314F紫外檢測器，杭州瑞析科技有限公司；TC-24/H(b)型基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；VITEK2Compact微生物全自動分析儀，法國梅里埃公司。

1.2 樣品制備

用濾紙吸干金線魚外表的水，稱重，加入30%的食鹽，按層魚層鹽的方法將魚腌制于不銹鋼盆中, 室溫腌制3 d后置于太陽下晾曬，在第1、2、3、4、5、7、10 d取樣檢測。

1.3 組胺含量檢測

參考《GB 5009.208—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》方法，用組胺磷酸鹽標(biāo)品配制標(biāo)準(zhǔn)使用液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取5 g腌魚于50 mL離心管中，加入TCA水溶液(100 g·L-1)15 mL，均質(zhì)1 min， 50 ℃超聲波處理30 min，3 000 r·min-1離心10 min后取上清液，水洗沉淀物2次過濾。合并濾液，吸取2 mL濾液置于分液漏斗，加入2～3滴NaOH 溶液(250 g·L-1)使濾液呈堿后，加入3 mL正戊醇，震蕩5 min，分別添加正戊醇3次，靜置15 min提取上層清液，定容至10 mL。準(zhǔn)確吸取2 mL正戊醇萃取液于分液漏斗，添加3 mL鹽酸，震蕩5 min，連續(xù)添加3次鹽酸溶液并震蕩后靜置15 min，收集下層的鹽酸萃取液并定容至10 mL，搖勻后以零管為參比，用紫外檢測器檢測萃取液的吸光度，代入組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出萃取液的組胺含量并計(jì)算腌魚的組胺含量。

1.4 產(chǎn)組胺細(xì)菌分離

根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)組胺使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)的原理，利用溴甲酚紫培養(yǎng)基的呈色反應(yīng)方法進(jìn)行篩選[1]。由于樣品含有多種氨基酸，細(xì)菌利用各類氨基酸產(chǎn)生的生物胺都會使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)，必須排除組胺外的其他生物胺的干擾，試驗(yàn)中采用二步篩選法進(jìn)行產(chǎn)組胺細(xì)菌分離。

第一步分離產(chǎn)生物胺的細(xì)菌：取25 g腌魚成品進(jìn)行碎處理，加入225 mL無菌水，并進(jìn)行梯度稀釋。對最后3個稀釋度分別用移液槍移取1 mL稀釋液于滅菌平皿，倒入下層培養(yǎng)基(蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1 g、葡萄糖0.1 g、瓊脂3.6 g、吐溫80 0.2 g、磷酸吡哆醛0.01 g、NaCl 0.5 g、MgSO40.08 g、K2HPO40.4 g、D-組氨酸10 g，L-組氨酸1 g、蒸餾水200 mL)10 mL左右輕輕混勻，凝固后于30 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落狀態(tài)并計(jì)算菌落總數(shù)，然后在表面注入5 mL上層培養(yǎng)基(1.6%溴甲酚紫-乙醇1 mL、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)覆蓋全部菌落，靜置5～10 min后觀察菌落顏色變化，變紫色或紫藍(lán)色的菌落則為形成生物胺的菌株，不變色或呈其他色澤的菌落則不形成生物胺。第二步篩選產(chǎn)組胺的細(xì)菌：用接種環(huán)小心挑取產(chǎn)生物胺的菌落接種于D、L-組氨酸瓊脂培養(yǎng)基(D-組氨酸10 g，L-組氨酸10 g，NaCl 5 g、磷酸吡哆醛0.01 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L, 調(diào)pH 6.0)平板，于30 ℃培養(yǎng)24～48 h至菌落長出充分長成，然后注入上層培養(yǎng)基5 mL左右覆蓋菌落，5～10 min變紫或紫藍(lán)色的菌落則為產(chǎn)組胺細(xì)菌。

1.5 細(xì)菌產(chǎn)組胺能力檢測

將分離細(xì)菌接種于產(chǎn)組胺能力檢測培養(yǎng)基(D/L-組氨酸10 g，大豆蛋白胨17 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸鈉10 g，NaCl 3 g，磷酸氫二鉀2.5 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH 6.0)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后按1.3所述的方法檢測組胺含量，產(chǎn)組胺含量高的菌株則為產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌。

1.6 產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定及生化鑒定

將產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并觀察細(xì)菌菌落特征，同時用全自動細(xì)菌鑒定儀作生化反應(yīng)鑒定。

1.7 產(chǎn)組胺細(xì)菌的基因序列鑒定

采用16S rDNA序列鑒定法。參考文獻(xiàn)方法[2]，將產(chǎn)組胺細(xì)菌制成菌懸液，用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司完成，將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌序列進(jìn)行比對和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線魚腌制過程組胺含量

將組胺標(biāo)準(zhǔn)液于波長480 nm處檢測吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Origin8.5對組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性分析，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式為y=0.006x+1.821 8，R2=0.999 4。

組胺含量及細(xì)菌總數(shù)結(jié)果如圖1所示，組胺含量與細(xì)菌總數(shù)的變化規(guī)律相似，在腌制第3天出現(xiàn)峰值，第4天開始下降，第7天之后降低至相對穩(wěn)定狀態(tài)。這可能是由于原料魚從冷藏條件到室溫條件的變化促使魚體內(nèi)細(xì)菌快速生長繁殖的緣故。隨著腌制時間的延長，食鹽的滲透作用使魚體的鹽濃度逐漸增大，水分逐漸流失減少，由此導(dǎo)致部分細(xì)菌受到抑制，導(dǎo)致第7～10天細(xì)菌總數(shù)降至最少。蔣倩倩等[3-4]認(rèn)為，腌魚的組胺含量在腌制前期上升，而在腌制后期下降，是由于其他微生物與產(chǎn)組胺細(xì)菌存在競爭和拮抗作用，從而使產(chǎn)組胺細(xì)菌生長受到抑制，或者部分組胺被降解的緣故。

圖1 腌制魚過程中組胺含量及細(xì)菌總數(shù)變化

2.2 細(xì)菌產(chǎn)組胺能力及關(guān)鍵細(xì)菌

篩選細(xì)菌得到7株產(chǎn)組胺菌， 產(chǎn)組胺能力如圖2所示，其中菌株T4和T6的產(chǎn)組胺量明顯大于其余5株細(xì)菌，由此確定T4和T6是產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌。

圖2 7株細(xì)菌培養(yǎng)48 h產(chǎn)組胺量

2.3 產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征與生化特性

細(xì)菌自動分析儀分析結(jié)果顯示，T4與馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)最接近, 相似度為96%，T6與蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)最接近，相似度為98%。鏡檢結(jié)果顯示，T4細(xì)胞為圓形，革蘭氏陽性，無芽孢，無運(yùn)動；菌落較小，圓形，邊緣整齊，米白色，表面光滑，不透明。T6細(xì)胞為桿狀, 革蘭氏陽性，有芽孢，會運(yùn)動；菌落較小，圓形，邊緣有缺刻，乳白色，表面粗糙無光澤，不透明。形態(tài)學(xué)檢測及生化檢測的結(jié)果顯示，T4、T6分別與蜂房芽孢桿菌和馬胃葡萄球菌和蜂房芽孢桿菌高度相似(表1)。

表1 2株產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌部分生化特征

注：-為陰性，+為陽性。

2.4 關(guān)鍵細(xì)菌的基因序列鑒定結(jié)果

將T4和T6的基因序列提交至NCBI, 提交號為2444712, 將所得基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的已知細(xì)菌序列進(jìn)行比對，結(jié)果T4與馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、T6與蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)相似度均達(dá)到100%。根據(jù)16S rDNA序列檢測結(jié)果構(gòu)建T4和T6的基因發(fā)育樹如圖3、4所示。

圖3 T4菌株基于16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

在腌制金線魚過程中，組胺含量呈現(xiàn)近似正態(tài)分布的變化規(guī)律。腌制初始階段，組胺含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，腌制第3天左右達(dá)到峰值，第4 天出現(xiàn)下降，直至第7～10天組胺含量降低至相對穩(wěn)定水平。分離細(xì)菌的結(jié)果顯示，細(xì)菌總數(shù)的變化也與組胺變化規(guī)律相似，其中產(chǎn)組胺細(xì)菌有7株，產(chǎn)組胺能力相參較強(qiáng)的細(xì)菌是馬胃葡萄球菌和蜂房芽孢桿菌。

楊健[5]在鮐魚產(chǎn)組胺微生物生物學(xué)特性研究中表明,低溫可以抑制產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長并能抑制其產(chǎn)生組胺，與本研究結(jié)果一致。吳素娟等[6]人認(rèn)為，隨著干制時間的推移，魚肉水分含量和水分活度不斷降低，到腌制后期，水分活度限制了產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長，導(dǎo)致組胺含量逐漸降低，這與本實(shí)驗(yàn)在第4～10天的干制階段發(fā)現(xiàn)組胺含量下降的結(jié)果類似。另外，曾令彬等[7]發(fā)現(xiàn)，腌魚中主要的微生物群是微球菌、葡萄球菌、乳酸菌和酵母菌等，部分微生物除了產(chǎn)組胺外，還會產(chǎn)生其他生物胺或其他呈味物質(zhì)[8]，由此產(chǎn)生腌魚理化性質(zhì)和質(zhì)構(gòu)的變化。陳玉峰等[9]建議在生產(chǎn)過程中采用低溫干燥的辦法抑制脫羧酶活性和產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長，從而有效控制腌制魚中組胺的生成?；谶@些研究報(bào)道，結(jié)合本研究結(jié)果，為了健康和安全地食用腌制魚，盡量選擇鹽漬后干制至第7天之后的腌魚進(jìn)行食用，或者采取特定的技術(shù)方法抑制產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌，降低腌制魚中組胺的生成量。

圖4 T6菌株基于16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹