周鋒 褚雪峰 史發(fā)蘭

【摘要】 目的 探討DNA損傷蒽環(huán)類藥物誘導MDM2產(chǎn)生剪切體的表達。方法 采用多種DNA損傷藥物處理原代胚胎成纖維細胞后， 分別利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-Time PCR）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測MDM2的剪接體表達， 進一步通過測序分析剪切體的序列。結(jié)果 蒽環(huán)類藥物可以誘導MDM2的第10號和第11號外顯子中間插入108 bp的片段， 并且該片段中含有終止密碼子， 促使丟失第11號和第12號外顯子。羥基脲（Hu）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）并不能誘導MDM2剪接體的產(chǎn)生。結(jié)論 蒽環(huán)類藥物可以誘導MDM2剪切體的表達。

【關鍵詞】 蒽環(huán)類藥物；MDM2；剪接體實時熒光定量聚合酶鏈式反應

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.35.113

【Abstract】 Objective To discuss the expression of DNA damage anthracyclines induced MDM2 spliceosome. Methods After treatment of primary embryonic fibroblasts with various DNA-damaging drugs， the expression of splicesome of MDM2 was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-Time PCR） and reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）， respectively， and the sequence of the splicing was further analyzed by sequencing. Results Anthracyclines can induce the insertion of 108 bp fragment between exons 10 and 11 of MDM2， and the fragment contains termination codon， which leads to the loss of exons 11 and 12. hydroxyurea （Hu） and 5-fluorouracil （Fu） could not induce the production of MDM2 splice. Conclusion Anthracyclines can induce the expression of MDM2 spliceosome.

【Key words】 Anthracyclines； MDM2； Spliceosome

MDM2是一個含有雙微體的蛋白， 在細胞內(nèi)主要作用參與調(diào)控真核細胞的生長、程序化死亡和DNA損傷的修復等[1-4]。MDM2位于人類染色體12q13-14上， 由12個外顯子編碼491個氨基酸[5]。MDM2的表達在人體正常多個組織和器官中， 骨骼肌中表達最高， 其次為肝、肺等， 與細胞的基本生理活動有關[6， 7]。此外， 在人類許多腫瘤中， 如肺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌中， 都可以檢測到MDM2基因的擴增表達[8-10]。MDM2具有多種功能， 研究最廣泛的是其具有E3泛素連接酶活性[11， 12]。在癌癥中其主要功能是降解抑癌基因P53， 促進腫瘤的形成[13]。但是突變或者過表達的P53也可以負反饋調(diào)節(jié)抑制MDM2的表達， 使其在癌癥中失去功能。MDM2主要的功能區(qū)域分成2個。第一個重要結(jié)構域是1～241位氨基酸， 主要功能是結(jié)合P53， 使P53調(diào)控細胞周期G1期的功能喪失同時調(diào)控細胞凋亡的功能失去。這個區(qū)域同時還可以結(jié)合P73和E2F1蛋白。第二個重要的結(jié)構域是242～331位氨基酸， 其中包含了C4種類的鋅指結(jié)構域， 具有重要的E3泛素化P53蛋白的能力[14]。另外MDM2含有一個核定位信號序列（NLS）， 包括核輸出信號（NES）和核定位信號（NoLS）[15]。 目前已知的MDM2轉(zhuǎn)錄由兩個啟動子控制， 可以產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本。這兩個啟動子最大的區(qū)別在于是否依賴于P53。第一個啟動子無P53的結(jié)合位點， 第二個啟動子區(qū)域中含有2個P53結(jié)合位點， 結(jié)合時可以激活MDM2的轉(zhuǎn)錄。研究還發(fā)現(xiàn)MDM2基因啟動子區(qū)域存在一個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點（SNP309）， SNP309位點突變時（T-G）， 會增強轉(zhuǎn)錄因子SP1與MDM2的結(jié)合增強， 進而上調(diào)MDM2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平， 促進腫瘤的形成。還有研究發(fā)現(xiàn)， PTEN可以通過P1啟動子調(diào)節(jié)MDM2的mRNA水平[16]。迄今為止， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在不同癌癥中MDM2有多達72種選擇性剪切[17， 18]。但是這些選擇性剪切產(chǎn)物的形成和誘因并不清楚。

蒽環(huán)類藥物是一類抗腫瘤效果非常顯著的藥物， 無論在血液腫瘤或者實體腫瘤中都具有很好的治療效果， 在癌癥的治療中具有極其重要的地位。目前， 常見的蒽環(huán)類藥物主要有阿霉素（Dox）、表阿霉素、柔紅霉素和伊比達星等[19]。蒽環(huán)類藥物作用于腫瘤的機制大多以DNA為作用靶點， 利用平面的稠環(huán)芳香結(jié)構嵌入到DNA的雙螺旋結(jié)構中， DNA聚合酶和核酸的合成過程受阻， 導致DNA雙鏈結(jié)構破壞， 阻礙了癌細胞的增殖， 最終發(fā)揮抗腫瘤的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷藥物Dox及蒽環(huán)類藥物均可以誘導MDM2剪切體的表達， 插入的剪切體可終止密碼子， 阻斷MDM2的轉(zhuǎn)錄， 使其失去了部分功能， 這一研究闡明了DNA損傷藥物蒽環(huán)類化療藥誘導MDM2剪切體表達的分子機制。為蒽環(huán)類藥物在腫瘤治療中的應用提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 實驗細胞：實驗用原代胚胎成纖維細胞（MEFs）取自懷孕13.5 d小鼠， 由實驗室自行制備。實驗試劑：HDMEM（高糖）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司。Realtime-PCR使用的SYBR購于日本TAKARA公司。RNA提取試劑TRIZOL試劑購自賽默飛公司。實驗用限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購于NEB公司。實驗所用的Dox、表阿霉素、柔紅霉素、伊比達星、Hu和5-Fu均購自Sigma公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 MEFs細胞制備與培養(yǎng) 首先將懷孕13.5 d的母鼠麻醉， 利用CO2處理母鼠致死后， 剪開腹壁暴露出子宮角。隨后取出胚胎將其轉(zhuǎn)移到含有PBS的培養(yǎng)皿中， 洗3遍。洗完后， 用眼科剪刀將組織剪碎， 大約碎塊1 mm3。吸出轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中， 加入2 ml胰蛋白酶/EDTA在37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育大約20 min。用10 ml培養(yǎng)基（含10%FBS）終止胰蛋白酶/EDTA的消化， 1500 rpm離心后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)。37℃培養(yǎng)過夜， 當培養(yǎng)瓶中的細胞長到80%～90%匯合時并仍處于指數(shù)生長期時， 可以進行實驗。

1. 2. 2 蒽環(huán)類藥物處理MEFs細胞 將MEFs細胞種6孔板后， 每孔1×106細胞， 分別利用10 ?M的阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、伊比達星和2 μl DMSO處理MEFs細胞， 作用24 h后提取RNA。

1. 2. 3 實時定量PCR檢測目的基因mRNA水平 采用TRIZOL法提取總RNA， 利用紫外分光光度計NANO Drop3000檢測RNA的純度及濃度。提取2 μg RNA利用cDNA第1條鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA， 成功后進行實時熒光定量PCR反應檢測。使用7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）， 按照Invitrogen PCR操作手冊進行Real-Time PCR。

PCR反應條件：95℃ 5 min預變性， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s共進行40個循環(huán)， 以2-△△CT值評估相對表達量。每組實驗設置3個復孔。所用實驗重復3次。在NCBI網(wǎng)站查取MDM2的基因序列NM_010786， 為了防止基因組DNA污染， 跨外顯子設計。

1. 3 統(tǒng)計學方法 用2-△△ct法處理實時熒光定量RT-PCR所得的CT數(shù)據(jù)， 采用SPSS 15.0軟件處理獲得的數(shù)據(jù)， 由于實驗組標本2-△△ct值不符合正態(tài)分布， 以2個獨立樣本檢驗進行統(tǒng)計分析；計量資料采用t檢驗， 計數(shù)資料采用χ2檢驗， P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 Dox誘導MEFs細胞出現(xiàn)MDM2的剪切體 利用誘導DNA損傷藥物Dox（Doxorubicin）處理MEFs細胞后， 提取RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行PCR檢測MDM2的表達。根據(jù)MDM2的序列， 在跨第10號和第11號外顯子設計引物， 目的片段長度150 bp， 見圖1。結(jié)果顯示， 在對照組（DMSO）檢測到了目的片段150 bp， 在Dox誘導組不僅檢測到了150 bp目的片段， 另外還檢測到了一條250 bp左右的片段。綜合以上結(jié)果， 準備對Dox處理MEFs細胞后MDM2剪切體250 bp片段進行下一步研究， 見圖2。

2. 2 Dox誘導MDM2剪切體的研究 利用誘導DNA損傷藥物Dox處理MEFs細胞后， 擴增MDM2后將250 bp片段切膠回收， 克隆到T載體后進行測序， 測序結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)在第10號和第11號外顯子之間插入了一段108 bp片段， 并且這段序列中有終止密碼子TGA。進一步根據(jù)這段序列設計Real time-PCR引物， 證實了Dox可以誘導MDM2的剪切體。見圖3。

2. 3 Hu和5-Fu不可以誘導MDM2的剪切體表達 誘導DNA損傷的藥物有很多種， 比如Hu、5-Fu等， 分別利用Hu和5-Fu處理MEFs細胞后， 進行PCR的檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有Dox可以誘導MDM2的剪切體表達， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖4， 圖5。

2. 4 蒽環(huán)類藥物均可以誘導MDM2的剪切體表達 蒽環(huán)類藥物主要包括Dox、表阿霉素、柔紅霉素和伊比達星等（見圖6）。為了探索MDM2剪切體的表達， 分別用這4種藥物處理MEFs細胞后， 進行PCR擴增檢測。結(jié)果顯示， 這4種藥物均可以誘導MDM2剪切體的表達， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖7， 見圖8。

3 討論

P53是一個DNA損傷應激蛋白， 可以參與調(diào)控細胞的凋亡， 細胞周期阻滯和細胞衰老[20， 21]。MDM2是P53的主要負調(diào)控基因， 通過泛素化降解P53[22]。目前， 很多研究發(fā)現(xiàn)MDM2的功能與它本身mRNA的選擇性剪切與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。在多種癌癥中都發(fā)現(xiàn)了MDM2存在不同的剪切體， 然而它的功能和發(fā)生原因還不清楚。本研究中發(fā)現(xiàn)了DNA損傷時可以誘導MDM2的選擇性剪接， 但是只有蒽環(huán)類的藥物可以誘導MDM2剪切體表達， 而其他化療藥物比如Hu和5-Fu并不能引起MDM2的選擇性剪切。蒽環(huán)類藥物主要包括Dox、表阿霉素、柔紅霉素和伊比沙星等廣泛地用于治療血液病和實體腫瘤， 比如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等[23]。蒽環(huán)類藥物優(yōu)點是具有抗瘤廣譜性， 抗瘤能力強， 療效好。但是引起的不良反應較嚴重， 主要是脫發(fā)和心臟毒性[24]。其作用機理主要是通過嵌入DNA雙鏈的堿基之間， 形成穩(wěn)定復合物， 抑制DNA復制與RNA合成， 從而阻礙快速生長的癌細胞的分裂[25]。Hu[26]和5-Fu[27]的作用機理不同于蒽環(huán)類藥物， 在體內(nèi)主要是引起DNA的單鏈斷裂， 影響DNA和RNA的生物合成， 抑制腫瘤細胞的增殖。這也許解釋了為何只有蒽環(huán)類藥物可以誘導MDM2的選擇性剪切， 接下來會深入研究具體的原因。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了MDM2的RNA新的剪切體， 通過測序解析了插入序列， 在10號外顯子后插入了終止密碼子， 阻斷了MDM2的轉(zhuǎn)錄及其蛋白質(zhì)的合成。MDM2的11號和12號外顯子編碼的蛋白是E3泛素連接酶結(jié)構域， 當MDM2失去E3泛素連接酶活性時， 就不能夠降解P53， 丟失了對P53的調(diào)控作用。本研究能夠更好的理解MDM2-P53通路復雜的調(diào)節(jié)機制， 并對靶向MDM2的化療藥物的開發(fā)具有重要的影響。

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[收稿日期：2018-06-29]