李 季 李廣文 張 悅 朱進(jìn)霞

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

多巴胺(dopamine, DA)是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，不僅廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在許多外周組織器官也能合成DA，如胃腸道、腎臟、胰腺等，并且參與胃腸動(dòng)力、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、胰腺內(nèi)外分泌等功能的調(diào)節(jié)[1-2]。近年來，越來越多的研究[3-4]表明，DA與血糖調(diào)節(jié)以及糖尿病之間存在聯(lián)系。DA通過與其受體結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用，但關(guān)于DA受體在胰腺組織和細(xì)胞系中的表達(dá)分布研究報(bào)道并不一致。

2005年，Rubi等[5]在大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1E細(xì)胞上用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)有D2受體的表達(dá)，并且激動(dòng)D2受體會(huì)抑制胰島素的分泌。而筆者前期研究[6]結(jié)果顯示DA受體D1、D2和D5廣泛分布在大鼠胰腺組織的內(nèi)分泌部，其中D1受體表達(dá)在分泌胰島素的β細(xì)胞上，D5受體表達(dá)在分泌胰高血糖素的α細(xì)胞和分泌胰多肽的PP細(xì)胞上，D2受體表達(dá)在分泌生長抑素的δ細(xì)胞上。還有研究者[7]應(yīng)用PET/CT顯像技術(shù)觀察到在大鼠胰腺組織中有D2/D3受體表達(dá)，但無法明確受體的具體細(xì)胞定位。也有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道在MIN6細(xì)胞系(小鼠胰島β細(xì)胞系)上表達(dá)D3受體，并且通過影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度抑制胰島素分泌。以上研究結(jié)果表明DA受體在胰腺組織中的分布與細(xì)胞系存在差異，而細(xì)胞系本身又存在腫瘤細(xì)胞的特性，與正常細(xì)胞存在差異[10]，也提示DA受體在胰腺組織和胰島β細(xì)胞系中可能存在分布差異，同時(shí)細(xì)胞系的功能與原代也可能存在差異。實(shí)驗(yàn)通過研究大鼠胰腺組織和胰島β細(xì)胞系INS-1(大鼠源)和HIT-T15(倉鼠源)細(xì)胞中DA受體的分布以及INS-1細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，為探究DA調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能以及研究結(jié)果不一致的可能原因提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(體質(zhì)量為200～220 g)，購于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[動(dòng)物許可證號為：SCXK(京) 2012-0001]，國家級動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利準(zhǔn)則，給予正常晝夜更替光照，24 h自由食水供應(yīng)。

1.2 組織制備與冰凍切片

SD大鼠急性頸椎脫臼處死，沿腹白線切口，進(jìn)入腹腔，迅速取出胰腺組織標(biāo)本，將脂肪等其他組織去除，置于預(yù)冷的中性4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)溶液中固定。24 h后，取出胰腺組織，入15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液脫水，16～18 h后再取出組織，入30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液再次進(jìn)行脫水處理，待組織沉于試管底部，取出組織，去除多余液體后置于充滿optimal cutting temperature compound(OCT包埋劑)的包埋盒中并經(jīng)過液氮固化制備成冰凍組織塊-80℃冰箱保存。用Leica冰凍切片機(jī)制備5μm厚度的大鼠胰腺組織冰凍切片，組織平整地貼于經(jīng)過多聚賴氨酸處理后的載玻片上，室溫晾干后于-20℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

大鼠胰島β細(xì)胞系(INS-1細(xì)胞)培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，含有10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，100 U/ mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES，1 mmol/L丙酮酸鈉，4 500 mg/L葡萄糖和 1 500 mg/L碳酸氫鈉。倉鼠胰島β細(xì)胞系(HIT-T15細(xì)胞)則置于F-12K完全培養(yǎng)基中，含有10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活的胎牛血清，100 U/ mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺和1 500 mg/L碳酸氫鈉(均來自美國Gibco公司)。在37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿中細(xì)胞密度融合為70%～80%左右時(shí)，需進(jìn)行傳代。細(xì)胞以2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板中進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色，以5.0×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中進(jìn)行胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。以上細(xì)胞購自美國American Type Culture Collection(ATCC)公司。

1.4 胰腺組織冰凍切片免疫熒光染色

將制備好的組織切片從-20℃取出，在室溫晾干，抗原修復(fù)后冷卻至室溫。將切片置于染缸中，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline-Tween-20，PBST)洗片5 min，共3次，用5%(體積分?jǐn)?shù))驢血清封閉非特異性抗原30 min，將封閉血清棄去，再滴加Ⅰ抗(用PBST稀釋)，濕盒4℃過夜。隔天取出切片，棄去Ⅰ抗，PBST洗5 min，共3次，滴加熒光Ⅱ抗(用PBST稀釋)，室溫孵育2 h，棄去Ⅱ抗，滴加DAPI染細(xì)胞核，室溫孵育5 min，PBST洗5 min，共3次，50%(體積分?jǐn)?shù))甘油封片，熒光顯微鏡下成像。在滴加熒光Ⅱ抗及之后的步驟注意避光。抗體信息詳見表1、2。

1.5 細(xì)胞免疫熒光染色

選取培養(yǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞(INS-1、HIT-T15細(xì)胞)，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次，每次2 min，之后消化細(xì)胞(步驟同前)，取24孔板，每孔加入經(jīng)過高壓滅菌的無菌蓋玻片1張，將細(xì)胞接種于24孔板中的蓋玻片上，每孔加1 mL完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱[37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取出24孔板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每次2 min，加入中性4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA固定15 min后，PBST洗 5 min，共3次，之后染色步驟同冰凍切片染色。封片時(shí)，將蓋玻片有接種細(xì)胞的那面用50%(體積分?jǐn)?shù))甘油貼于載玻片上，熒光顯微鏡下成像?？贵w信息見表1，2。

1.6 INS-1細(xì)胞胰島素分泌實(shí)驗(yàn)

INS-1細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。過夜培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)基更換為 1 mL 的無糖Krebs-Ringer bicarbonate HEPES(KRBH)溶液，在培養(yǎng)箱中[37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]穩(wěn)定30 min后，換為1 mL含有 2 mmol/L 葡萄糖的 KRBH 液中繼續(xù)再孵育培養(yǎng)1 h，每孔取300 μL液體用于胰島素和胰高血糖素的測定，棄去剩余的KRBH液，之后每孔給予1 mL含有20 mmol/L葡萄糖的KRBH 溶液，孵育1 h后每孔再次留取孵育液體用于胰島素和胰高血糖素的測定。實(shí)驗(yàn)采用放射免疫方法測定孵育液中胰島素和胰高血糖素的濃度(北方生物技術(shù)有限公司)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用Ⅰ抗信息Tab.1 Information of primary antibody

表2 實(shí)驗(yàn)所用Ⅱ抗信息Tab.2 Information of secondary antibody

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 多巴胺受體在大鼠胰腺組織的分布

為了探究DA受體在大鼠胰腺組織中的分布，我們運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法，利用4種胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物的抗體，即胰島素(insulin, INS)標(biāo)記β細(xì)胞，胰高血糖素(glucagon, GLU)標(biāo)記α細(xì)胞，生長抑素(somatostatin, SST)標(biāo)記δ細(xì)胞和胰多肽(pancreatic polypeptide,PP)標(biāo)記PP細(xì)胞，與不同亞型的DA受體進(jìn)行免疫熒光染色，并運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡成像。如圖1所示：在大鼠胰腺組織中，DA受體D1、D2和D5分布于胰腺組織的內(nèi)分泌部的不同細(xì)胞上，其中D1受體表達(dá)在β細(xì)胞上，D2受體表達(dá)δ細(xì)胞上，D5受體表達(dá)在的α細(xì)胞和PP細(xì)胞上。

2.2 多巴胺受體在胰島β細(xì)胞系INS-1和HIT-T15細(xì)胞上的分布

在INS-1細(xì)胞中，D1、D2和D5受體均有表達(dá)，并且細(xì)胞均表達(dá)INS免疫陽性，與受體表達(dá)存在共定位(圖2A)。

在HIT-T15細(xì)胞中也觀察到3種受體D1、D2和D5的表達(dá)(圖2B)。以上結(jié)果表明，DA受體在胰島β細(xì)胞系中的分布不同于原位的胰島β細(xì)胞。

2.3 INS-1細(xì)胞的內(nèi)分泌功能不同于原位β細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)顯示這兩種胰島β細(xì)胞系的同一個(gè)細(xì)胞不僅表現(xiàn)INS免疫陽性，同時(shí)也表現(xiàn)GLU免疫陽性(圖3A和B)。而在大鼠胰腺組織中，INS和GLU免疫陽性則分別表達(dá)在不同的細(xì)胞上(圖3C)。進(jìn)一步用放射免疫法測定了 INS-1細(xì)胞孵育液(KRBH 緩沖液)中是否含有胰高血糖素。在沒有接種INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，檢測不到胰島素和胰高血糖素，接種INS-1細(xì)胞后，既可檢測到胰島素，也可檢測到胰高血糖素，胰島素濃度會(huì)在20 mmol/L高糖刺激下明顯升高(t=4.708,P=0.000 8,n=6)，而胰高血糖素的濃度則沒有明顯變化(t=0.3451,P=0.7418,n=4)，詳見表3。

圖1 多巴胺受體在大鼠胰腺組織的分布Fig.1 Distribution of dopamine receptors in rat pancreatic islets

Red fluorescence for dopamine receptors, and green fluorescence for INS-, SST-，GLU- and PP-immunoreactivity.Scalebars：100 μm；INS：insulin；SST：somatostatin；GLU：glucagon;PP:pancreatic polypeptide.

圖2 多巴胺受體在INS-1和HIT-T15細(xì)胞上的表達(dá)Fig.2 Distribution of dopamine receptors in INS-1 and HIT-T15 cells

Green fluorescence for dopamine receptors, and red fluorescence for INS-immunoreactivity.A：INS-1 cell;B: HIT-T15 cell；Scalebars：25, 10 μm.INS-1：insulin-1.

圖3 INS和GLU在INS-1、HIT-T15細(xì)胞和大鼠胰腺組織上的表達(dá)Fig.3 Distribution of INS- and GLU-immunoreactivity in INS-1、HIT-T15 cells and rat pancreatic tissue

Green fluorescence staining for INS-immunoreactivity, and red fluorescence staining for GLU-immunoreactivity.A：INS-1 cell;B: HIT-T15 cell;C: Rat pancreatic tissue；Scalebars：100, 25, 10μm；INS-1：insulin-1.

表3 INS-1細(xì)胞孵育液中胰島素和胰高血糖素濃度Tab.3 Insulin and glucagon content in INS-1 cell supernatant

3 討論

DA及其受體參與胰腺功能調(diào)節(jié)的作用被廣泛研究，盡管其對內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)作用存在許多爭議，但是大量研究[11]都表明DA對胰腺內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)存在關(guān)鍵性作用。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)一步探究了DA受體在原位胰腺組織和胰島β細(xì)胞系中的分布以及INS-1細(xì)胞的內(nèi)分泌功能。

1977年，Hansen等[12]首次在新鮮分離的小鼠胰島的勻漿液中檢測到DA。Mahony和Feldman等[13]進(jìn)一步在金黃地鼠的胰島研究了單胺類遞質(zhì)在胰島中攝取和作用，但他們也強(qiáng)調(diào)，對來自不同物種的胰島進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果存在巨大差異。同樣，關(guān)于DA受體在不同物種的胰腺組織和細(xì)胞系中的表達(dá)分布的研究報(bào)道也存在差異性。在原位組織中的結(jié)果表明，不同DA受體的亞型分布在大鼠胰腺組織的內(nèi)分泌部中不同的內(nèi)分泌細(xì)胞上[6]。而在不同的胰島β細(xì)胞系的研究中，其研究結(jié)果也存在差異性。在大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1E細(xì)胞上用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)有D2受體表達(dá)在該細(xì)胞上[5]，在MIN6細(xì)胞系上表達(dá)D3受體[8]。此外，與DA合成和代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平在小鼠原代分離的胰島和MIN6細(xì)胞中也不一致[9]。筆者在胰島β細(xì)胞系INS-1和HIT-T15觀察了DA受體的分布，發(fā)現(xiàn)該兩種細(xì)胞系均同時(shí)表達(dá)D1、D2和D5受體，與組織中的分布不一致，文獻(xiàn)[14]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)本身就與原代細(xì)胞存在差異，培養(yǎng)的細(xì)胞系中的細(xì)胞處于不盡相同的細(xì)胞時(shí)期，因此可能也具有不同的表現(xiàn)[15]。

此外，腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境也同正常的細(xì)胞存在差異，也可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)功能性上的差異[16-18]。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)這兩種胰島β細(xì)胞系同一個(gè)細(xì)胞不僅表達(dá)INS免疫陽性，同時(shí)表達(dá)GLU免疫陽性，而在原位組織中，INS和GLU免疫陽性則表達(dá)在不同的細(xì)胞上。進(jìn)一步在INS-1細(xì)胞孵育液中既可以檢測到胰島素，也可以檢測到胰高血糖素，提示胰島β細(xì)胞系的內(nèi)分泌功能不同于原位β細(xì)胞。

本研究證明了DA受體在大鼠胰腺組織和胰島β細(xì)胞系中存在差異性分布，胰島β細(xì)胞系內(nèi)分泌功能也不同于原位β細(xì)胞，為研究胰島β細(xì)胞的功能以及DA對胰島素分泌的調(diào)節(jié)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。