PP242通過下調Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路與柔紅霉素存在協(xié)同抗急性白血病作用

石芳芳 陳琪 楊曉凈 龔玉萍 陳一瑞

[摘要] 目的 通過研究PP242單藥及與柔紅霉素（DNR）聯(lián)合抗急性白血病的效應及作用機制，探尋急性白血病治療的新方法。 方法 以NB4、THP-1、SUP-B15三種急性白血病細胞株為研究模型，采用MTT藥物敏感試驗檢測PP242、DNR單藥及兩藥聯(lián)合的抗細胞增殖作用；Western Blot方法分析藥物對Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路關鍵點蛋白磷酸化的表達水平的影響；7-甲基鳥嘌呤帽親和分析法分析藥物對eIF4F翻譯起始復合物中4EBP1、eIF4E、eIF4G表達的影響；流式細胞學檢測PP242的促凋亡作用。 結果 （1）MTT顯示PP242、DNR單藥對急性白血病細胞株均有顯著的抗細胞增殖作用，而100 nmol/L的PP242與DNR聯(lián)合使IC50下降明顯，計算協(xié)同指數(shù)均小于1，表明兩藥存在協(xié)同作用。（2）Western Blot顯示PP242可有效下調Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E軸的關鍵磷酸化蛋白及Mcl-1表達，而DNR卻反饋上調這個通路的蛋白表達，PP242可協(xié)同DNR下調這條通路表達。（3）7-甲基鳥嘌呤帽親和分析法顯示PP242可增加eIF4E與4EBP1的結合，減少與eIF4G的結合，從而抑制eIF4F的形成，而DNR單藥并沒有這個作用。（4）流式細胞學顯示PP242可促進細胞凋亡發(fā)生。 結論 PP242單藥可抑制三種急性白血病細胞株的增殖，具有明顯的抗急性白血病作用，分析其可能作用機制為：通過抑制Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路活性，抑制eIF4F翻譯起始復合物形成以及促進細胞凋亡的發(fā)生。PP242與DNR聯(lián)合有協(xié)同抗急性白血病作用。

[關鍵詞] PP242；柔紅霉素；急性白血病；協(xié)同作用；Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E軸；eIF4F翻譯起始復合物；細胞凋亡

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）27-0007-06

[Abstract] Objective To explore a new method for the treatment of acute leukemia by studying the effects and mechanisms of PP242 monotherapy and combination therapy of PP242 and daunorubicin（DNR） in acute leukemia. Methods NB4， THP-1 and SUP-B15 were used as the research model. MTT drug sensitivity test was used to detect the anti-cell proliferation of PP242， DNR and the combination of the two drugs. The Western Blot method was used to analyze the effect of drugs on expression level of key protein phosphorylation in Akt/Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E signaling pathway. 7-methylguanine cap affinity analysis method was used to analyze the effect of drugs on the expression of 4EBP1， eIF4E and eIF4G in eIF4F translation initiation complex. Cytological detection was used to detect the pro-apoptotic effect of PP242. Results （1）MTT showed that PP242 or DNR alone had significant anti-cell proliferation effects on acute leukemia cell lines， and 100 nmol/L PP242 combined with DNR decreased the IC50. The calculated synergy index was less than 1， indicating that there was synergy effect between the two drugs. （2）Western Blot showed that PP242 could effectively down-regulate the key phosphorylation protein and Mcl-1 expression of Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E axis， while DNR feedbackly up-regulated the protein expression of this pathway. PP242 could down-regulate this pathway expression in collaboration with DNR. （3）7-methyl guanine cap affinity analysis showed that PP242 could increase the binding of eIF4E to 4EBP1， reduce the binding to eIF4G， and thus inhibit the formation of eIF4F， but DNR alone didnt have this effect. （4）Flow cytology showed that PP242 could promote apoptosis. Conclusion PP242 alone can inhibit the proliferation of three acute leukemia cell lines and has obvious anti-acute leukemia effect. The possible mechanism of action is to inhibit the eIF4F translation initiation complex and promote the occurrence of apoptosis by inhibiting the activity of Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E signaling pathway. PP242 and DNR have synergistic anti-acute leukemia effects.

[Key words] PP242； Daunorubicin； Acute leukemia； Synergy； Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E axis； eIF4F translation initiation complex； Apoptosis

急性白血病是一類嚴重危害人類身體健康的造血干祖細胞惡性增殖性疾病。目前，急性白血病的治療仍以化療為主，雖然柔紅霉素（DNR）為主的化療方案其完全緩解率（CR）已高達70%～80%，但是仍有相當部分患者由于對化療藥物耐藥而不能緩解，或出現(xiàn)復發(fā)，最終死亡。因此，尋找新的治療藥物已成必然[1，2]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)Akt/mTOR信號通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[3]，mTOR由于組成不同可分為mTORC1和mTORC2[4-6]。mTORC1通過磷酸化其下游4EBP1等調控相關蛋白的翻譯[7，8]。當4EBP1被mTORC1磷酸化后，其與eIF4E的結合力減弱，釋放出的eIF4E即與eIF4G、eIF4A形成翻譯起始復合物eIF4F，開始蛋白質的翻譯過程，被翻譯的下游蛋白包括抗凋亡因子Mcl-1等與細胞增殖、凋亡有關的重要蛋白[9]。mTORC2活化后可以磷酸化Akt Ser473位點，從而活化mTORC1、4EBP1，這一反饋因mTORC1抑制劑雷帕霉素不能完全抑制4EBP1磷酸化及功能的原因[10，11]。

PP242是一種新型的小分子mTOR雙靶向抑制劑，取消了mTORC2的反饋作用，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應[12-15]。目前，有關PP242對急性白血病細胞株的抗白血病作用報道逐漸增多，但PP242與柔紅霉素聯(lián)合對多種急性白血病細胞株作用的報道仍不多見。

因此，接下來將研究PP242單用及聯(lián)合柔紅霉素對多種急性白血病細胞株的抗白血病作用，并探討可能的作用機制。

1材料與方法

1.1細胞株和試劑

人類急性早幼粒細胞白血病細胞株（NB4），急性粒單核細胞白血病細胞株（THP-1），Ph+急性淋巴細胞白血病細胞株（SUP-B15，表達P190 BCR-ABL融合蛋白），以上細胞株均由四川大學華西醫(yī)院血液科實驗室提供，實驗時間為2015年3月～2017年12月。SUP-B15細胞株培養(yǎng)于含有10%小牛血清和100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中，NB4、THP-1細胞株培養(yǎng)于含有10%小牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2～3 d 傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。PP242（sigma，美國）用DMSO溶解配制成10 mmol/L母液，凍存在-20℃，使用前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成適當?shù)墓ぷ鳚舛取?/p>

1.2 MTT藥物敏感實驗及IC50值測定

采用MTT藥物敏感實驗檢測細胞增殖情況。細胞株每個孔加5×104個細胞，按實驗分組加入不同濃度藥物，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，再置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加入MTT三聯(lián)溶解液100 μL，繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中過夜。第2天用酶標儀測定每孔在570 nm處的吸光度值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=1-（實驗孔平均OD值-空白孔OD值）/（對照孔平均OD值-空白孔OD值），繪制生長曲線。根據(jù)藥物對細胞的抑制與藥物濃度對數(shù)呈正比的原理，利用SPSS17.0中的Probit analys模型，計算出藥物對細胞作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）[16]。采用協(xié)同指數(shù)（CI值）來判斷兩種藥物是否存在協(xié)同抑制細胞增殖的作用，計算公式如下：CI=D1/Dx1+D2/Dx2（D1、D2表示藥物單獨作用時達到某一細胞抑制作用時各自的藥物濃度，Dx1、Dx2表示兩種藥物聯(lián)合時達到相同細胞抑制作用時的藥物濃度）。CI=1表示兩藥存在疊加作用；CI>1表示兩藥存在拮抗作用；CI<1表示兩藥存在協(xié)同作用[17]。所有實驗至少重復3次。

1.3 Western blot 檢測

收集經過不同藥物處理24 h后的1×107個急性白血病細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取30～120 μg的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，使用以下一抗：Akt，P-Akt（Ser473），mTOR，P-mTOR（Ser2448），4EBP1，P-4EBP1（Thr37/46），eIF4E，P-eIF4E（Ser209），Mcl-1，GAPDH和辣根過氧化物酶標記的二抗（Cell Signalling Technology，美國）進行免疫印跡分析。最后經ECL發(fā)光系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）曝光顯影，使用Quantity One軟件采集圖像，分析蛋白表達。

1.4 7-甲基鳥嘌呤帽親和分析

用500 μL RIPA裂解液裂解不同藥物處理24 h后的1×107個急性白血病細胞，提取總蛋白，離心所得上清液中加入50 μL 7m-GTP-Sepharose beads（GE Healthcare），置于4℃孵育1～2 h，總蛋白中的eIF4E與 beads相結合。再次離心，移去上清液，小珠子（beads）用1 mL PBS洗滌3次，50 μL上樣緩沖液加入到珠子中，煮沸7 min。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，一抗4EBP1、eIF4E行免疫印跡分析[18]。

1.5 流式細胞凋亡檢測

取SUP-B15、NB4、THP-1細胞，以1×106個/孔的細胞量接種至 6孔板中，分別加入PP242（實驗孔）和PBS（對照孔），置37℃、5%CO2孵箱中孵育72 h。之后分別收集每個孔內的細胞，用Annexin V-FITC和propidium iodide（PI）（凱基生物公司，中國）雙染法在流式細胞儀上進行細胞凋亡檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0進行分析，以上每部分實驗均重復至少三次，MTT、流式細胞學檢測數(shù)據(jù)取平均值±標準差作為最后的實驗數(shù)據(jù)，蛋白水平表達通過Quantity One軟件進行相對定量比較。各個樣本（計量資料）之間比較采用t檢驗或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 PP242和柔紅霉素單藥對急性白血病細胞株均具有抗細胞增殖作用

NB4、THP-1、SUP-B15三種急性白血病細胞株分別培養(yǎng)在遞增濃度的PP242和柔紅霉素（DNR）中72 h，MTT結果顯示PP242、柔紅霉素單藥對三種急性白血病細胞株的細胞抑制率分別隨藥物濃度增大而增加，兩藥最大抑制率都接近100%（圖1A、C）。PP242單藥作用于NB4、THP-1、SUP-B15細胞株72 h后的IC50分別為0.423 μmol/L、2.169 μmol/L、0.069 μmol/L（圖1B），柔紅霉素單藥作用于NB4、THP-1、SUP-B15細胞株72 h后的 IC50值分別為0.007 μmol/L、0.045 μmol/L、0.004 μmol/L（圖1D）。這些結果提示PP242、DNR單藥均可濃度依賴地抑制三種急性白血病細胞株的增殖。

2.2 PP242可協(xié)同促進柔紅霉素對三種急性白血病細胞株的抗細胞增殖作用

不同濃度的柔紅霉素聯(lián)合100 nmol/L的PP242分別作用于NB4、THP-1、SUP-B15三種細胞株，其細胞抑制率分別隨柔紅霉素濃度增大而增加，最大抑制率均接近100%（圖2A），柔紅霉素的IC50值分別降低到了0.004 μmol/L、0.025 μmol/L、0.002 μmol/L（圖2B）。與柔紅霉素單藥相比，IC50值分別降低了42.9%、44.4%、50.0%。采用CI值作為判斷藥物相互作用的指數(shù)。以上三種細胞株中PP242與柔紅霉素的CI值分別為0.81、0.60、0.34，均小于1（圖2C）。這些結果提示PP242和柔紅霉素在三種白血病細胞株中均存在協(xié)同抑制細胞增殖的作用。

2.3 Western Blot檢測PP242與柔紅霉素對急性白血病細胞株中Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路及下游Mcl-1的作用

Western Blot分析發(fā)現(xiàn)在NB4、THP-1、SUP-B15三種急性白血病細胞株中，柔紅霉素單獨應用24 h后均不同程度上調了P-Akt（Ser473）、P-mTOR（Ser2448）、P-4EBP1（Thr37/46）、P-eIF4E（Ser209）的蛋白表達，相應總蛋白水平沒有變化；柔紅霉素對此通路下游靶蛋白Mcl-1的表達調節(jié)作用并不確切。而PP242單藥作用下，以上這些磷酸化蛋白及Mcl-1蛋白表達水平均明顯下降，尤其是兩者聯(lián)合應用時，下調作用更加顯著，在三種急性白血病細胞株中均得到相似的結果。結果顯示柔紅霉素可協(xié)同PP242下調Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路中相關蛋白的表達。見圖3。

2.4 PP242和柔紅霉素分別對三種急性白血病細胞株中eIF4F復合物的作用

通過Western Blot檢測裂解細胞后的總蛋白，發(fā)現(xiàn)含有PP242的細胞和含有柔紅霉素的細胞中4EBP1、eIF4E和eIF4G總蛋白含量沒有減少。接下來檢測7-甲基鳥嘌呤帽親和分析后的蛋白，發(fā)現(xiàn)PP242單獨作用下親和分析后的蛋白中eIF4G含量減少，4EBP1含量增加，4EBP1與eIF4E緊密結合增加，阻止eIF4E與eIF4G結合形成eIF4F起始復合物。而柔紅霉素并沒有表現(xiàn)出與PP242同樣的作用。PP242與柔紅霉素兩藥聯(lián)合后，eIF4G含量的減少以及4EBP1含量的增加程度與PP242單藥作用相似甚至更加明顯。結果顯示PP242與柔紅霉素兩藥聯(lián)合后可以抑制eIF4F復合物的生成。見圖4。

2.5 流式細胞技術檢測PP242對三種急性白血病細胞株凋亡的作用

通過流式細胞學Annexin V-FITC和PI雙染法檢測PP242對三種急性白血病細胞凋亡的作用。2.0 μmol/L的PP242作用于THP-1、SUP-B15、NB4細胞72 h后的平均細胞凋亡率分別為38.1%、23.5%、14.3%（圖5A～D）。與各自細胞株對照組（PBS）的平均細胞凋亡率進行比較，差異存在統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。結果顯示PP242對三種急性白血病細胞株具有促細胞凋亡發(fā)生的作用。

3討論

PP242是一種吡唑并嘧啶類化合物，和PP30一樣是小分子靶向抑制劑，由Feldman等合成，能同時抑制mTORC1和mTORC2復合物，已被證明是一種有效且選擇性高的ATP競爭性mTOR抑制劑[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，PP242對mTORC2的抑制作用并不能完全抑制Akt的磷酸化，但是對4EBP1的抑制作用比雷帕霉素更徹底，這也許與PP242可更強地抑制mTORC1有關；研究還提出PP242的抗細胞增殖作用是由于其可更強地抑制4EBP1的磷酸化和eIF4E活性[16]。

通過MTT實驗得知PP242單藥對NB4、THP-1、SUP-B15三種急性白血病細胞株具有濃度依賴的抗細胞增殖作用，柔紅霉素單藥亦可濃度依賴地抑制以上急性白血病細胞的增殖，且兩者最大抑制率都接近100%。而柔紅霉素聯(lián)合PP242作用于三種細胞株時，與單藥相比，具有更強的增殖抑制作用，各自的CI值均<1，說明兩藥的抗急性白血病作用是協(xié)同關系。

近年來的研究表明，多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤尤其是白血病存在Akt/mTOR及其相關信號通路的異常激活[17-19]。mTOR下游重要蛋白4EBP1可抑制eIF4F中的主要組成因子eIF4E的功能，4EBP1在低磷酸化狀態(tài)時與eIF4E緊密結合，阻止eIF4E與錨定蛋白eIF4G結合形成eIF4F起始復合物，從而不能進行mRNA翻譯[20]。30%惡性腫瘤包括直腸癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病等存在eIF4E的過度表達，從而選擇性地促進帽依賴蛋白的表達，導致腫瘤的發(fā)生[21，22]。因此，課題組從以上相關信號通路方面研究了PP242單藥及聯(lián)合柔紅霉素抗急性白血病效應可能的具體作用機制。本實驗中PP242可以顯著下調白血病細胞株中P-Akt（S473）的表達（mTORC2的下游底物），也下調P-mTOR（S2448）和P-4EBP1（T37/46）蛋白水平，說明PP242可同時抑制mTORC1和mTORC2。PP242也明顯下調了P-eIF4E（S209）、Mcl-1蛋白的表達，與柔紅霉素聯(lián)用時這種下調作用更加明顯。然而柔紅霉素單藥非但沒能下調這些蛋白，反而存在普遍活化上調Akt/mTOR通路的情況。由此認為Akt/mTOR通路的反饋上調可能為柔紅霉素單用的一個巨大副作用，PP242正好可以消除這個作用，也許這正是兩者協(xié)同抗急性白血病的其中一個分子機制。

eIF4F即翻譯起始復合物，調控著與細胞生長、增殖、凋亡有關的許多種重要蛋白，包括抗凋亡因子Mcl-1、細胞周期調控子cyclin D1和D3、原癌蛋白c-myc等。在蛋白質翻譯起始復合物組成的所有起始因子中，由于eIF4E在細胞內的水平最低（低于其他起始因子的10～30倍），它與eIF4G結合形成eIF4F起始復合物的過程成為翻譯開始的限速步驟，也成為控制蛋白質翻譯和表達的關鍵點。本研究結果顯示PP242可以下調三種急性白血病細胞株的P-4EBP1、P-eIF4E水平，兩者水平的下降理論上都將減少eIF4F的合成量，從而不能進行mRNA翻譯。而通過7-甲基鳥嘌呤帽親和分析確實發(fā)現(xiàn)PP242作用于細胞株后可減少eIF4F的合成，然而柔紅霉素單藥并沒有這個作用。由此猜測，PP242可通過下調mRNA翻譯功能，從而達到抑制腫瘤細胞生長的作用，但是柔紅霉素單藥卻沒有這個功能，不過兩藥聯(lián)合時可相同程度甚至更加顯著地下調mRNA翻譯功能。這可能是PP242與柔紅霉素具有協(xié)同抗急性白血病作用的另一個重要的分子機制。

Mcl-1是Bcl-2家族中的一個抗凋亡蛋白，在許多腫瘤中高表達，包括B系和T系惡性血液腫瘤[23]。Mcl-1蛋白表達通過Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路被調節(jié)，抑制mTOR的活性可以減少Mcl-1的蛋白合成；同時Mcl-1也是eIF4F下游翻譯的一個蛋白[24]。Mcl-1屬于抗凋亡蛋白，抑制Mcl-1的蛋白合成可以促進腫瘤細胞的凋亡。本研究結果顯示，PP242可以下調白血病細胞株中Mcl-1蛋白的表達水平，且流式細胞學分析也檢測到PP242可以促進三種急性白血病細胞株的細胞凋亡發(fā)生。由此提示，PP242促進急性白血病細胞凋亡的發(fā)生可能為其抗急性白血病作用的分子機制之一，Mcl-1蛋白也可成為今后抗腫瘤的一個重要靶點。

綜上所述，PP242單藥，尤其是PP242聯(lián)合柔紅霉素，對NB4、THP-1、SUP-B15三種急性白血病細胞株主要通過下調Akt/mTOR/4EBP1/eIF4E信號通路活性，從而進一步抑制eIF4F翻譯起始復合物形成以及促進細胞凋亡的發(fā)生而存在協(xié)同抗急性白血病的作用。PP242單獨以及聯(lián)合柔紅霉素在治療急性白血病領域具有廣大的應用前景。

[參考文獻]

[1] Yates JW，Wallace HJ Jr. Cytosine arabinoside（NSC-63878）and daunorubicin （NSC-83142） therapy in acute nonlymphocytic leukemia[J]. Cancer Chemother Rep，1973， 57（4）：485-488.

[2] Wiernik PH，Banks PL，Case DC Jr，et al. Cytarabine plus idarubicin or daunorubicin as induction and consolidation therapy for previously untreated adult patients with acute myeloid leukemia[J]. Blood，1992，79（2）：313-319.

[3] Xu G，Zhang W，Bertram P，et al. Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTEN/AKT/mTOR pathway in common human tumor[J]. Int J Oncol，2004，24（4）：893-900.

[4] Park CM，Park MJ，Kwak HJ，et al. Ionizing radiation enhances matrix metalloproteinase-2 Secretion and invadion of Glioma cells through src/epidermal growth factor receptor-mediated p38/Akt and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways[J]. Cancer Res，2006，66（17）：8511-8519.

[5] Wullschleger S，Loewith R，Hall MN. TOR signaling in growth and metabolism[J]. Cell， 2006，124（3）：471-484.

[6] Kuo HP，Lee DF，Chen CT，et al. ARD1 stabilization of TSC2 suppresses tumorigenesis through the mTOR signaling pathway[J]. Sci Signal，2010，3（108）：ra9.

[7] Foster KG，F(xiàn)ingar DC. Mammalian target of rapamycin（mTOR）：Conducting the cellular signaling symphony[J]. Biol Chem，2010，285（19）：14071-14077.

[8] Chow S，Minden MD，Hedley DW. Constitutive phosphorylation of the S6 ribosomal protein via mTOR and ERK signaling in the peripheral blasts of acute leukemia patients[J]. Exp Hematol，2006，34（9）：1183-1191.

[9] Coleman LJ，Peter MB，Teall TJ，et al. Combined analysis of eIF4E and 4E-binding protein expression predicts breast cancer survival and estimates eIF4E activity[J]. Br J Cancer， 2009，100（9）：1393-1399.

[10] Sonenberg N. eIF4E，the mRNA cap-binding protein：From basic discovery to translational research[J]. Biochem Cell Biol，2008，86（2）：178-183.

[11] Sarbassov DD，Guertin DA，Ali SM，et al. Phosphorylation and regulation of AKT/PKB by the rictor-mTOR complex[J]. Science，2005，307（5712）：1098-1101.

[12] Thoreen CC，Kang SA，Chang JW，et al. An ATP-competitive mammalian target of rapamycin inhibitor reveals rapamycin-resistant functions of mTORC1[J]. J Biol Chem， 2009，284（12）：8023-8032.

[13] Yu K，Shi C，Toral-Barza L，et al. Beyond rapalog therapy：Preclinical pharmacology and antitumor activity of WYE-125132，an ATP-competitive and specific inhibitor of mTORC1 and mTORC2[J]. Cancer Res，2010， 70（2）：621-631.

[14] Hoang B，F(xiàn)rost P，Shi Y，et al. Targeting TORC2 in multiple myeloma with a new mTOR kinase inhibitor [J]. Blood，2010，116（22）：4560-4568.

[15] Feldman ME，Apsel B，Uotila A，et al. Active-site inhibitors of mTOR target rapamycin-resistant outputs of mTORC1 and mTORC2[J]. PLoS Biol，2009，7（2）：e38.

[16] 周一平. 用SPSS軟件計算新藥的ID50[J].藥學進展，2003，27（5）：314-316.

[17] Guo Y，Shan Q，Gong Y，et al. Oridonin in combination with imatinib exerts synergetic anti-leukemia effect in Ph+acute lymphoblastic leukemia cells in vitro by inhibiting activation of LYN/mTOR signaling pathway[J]. Cancer Biol Ther，2012，13（13）：1244-1254.

[18] Hirase C，Maeda Y，Takai S，et al. Hypersensitivity of Ph-positive lymphoid cell lines to rapamycin：Possible clinical application of mTOR inhibitor[J]. Leuk Res，2009， 33（3）： 450-459.

[19] Hoang B，Benavides A，Shi Y，et al. The PP242 mammalian target of rapamycin（mTOR） inhibitor activates extracellular signal-regulated kinase（ERK） in multiple myeloma cells via a target of rapamycin complex 1（TORC1）/eukaryotic translation initiation factor 4E （eIF-4E）/RAF pathway and activation is a mechanism of resistance[J]. J Biol Chem， 2012，287（26）：21796-21805.

[20] Lin X，Morgan-Lappe S，Huang X，et al.‘Seed analysis of off-target siRNAs reveals an essential role of Mcl-1 in resistance to the small-molecule Bcl-2/Bcl-XL inhibitor ABT-737[J]. Oncogene，2007，26（27）：3972-3979.

[21] 楊曦，龔玉萍，楊雷，等. 雷帕霉素單藥及聯(lián)合硼替佐米、柔紅霉素對白血病細胞株抗腫瘤效應的研究[J].中華血液學雜志，2010，31（3）：201-203.

[22] Yang X，Lin J，Gong Y，et al. Antileukaemia effect of rapamycin alone or in combination with daunorubicin on Ph+acute lymphoblastic leukaemia cell line[J]. Hematol Oncol，2012， 30（3）：123-130.

[23] Chen S，Dai Y，Harada H，et al. Mcl-1 down-regulation potentiates ABT-737 lethality by cooperatively inducing Bak activation and Bax translocation[J]. Cancer Res，2007， 67（2）：782-791.

[24] Jonathan L，Coloff，Andrew N，et al. Akt-dependent glucose metabolism promotes Mcl-1 synthesis to maintain cell survival and resistance to Bcl-2 inhibition[J]. Cancer Res，2011，71（15）：5204-5213.

（收稿日期：2018-05-22）