劉斐 劉壽榮 傅曉晴 郭曉鳳 劉春濤 武瑞 李春青

[摘要] 目的 探討恩替卡韋（ETV）初治應(yīng)答不佳的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者體內(nèi)乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄區(qū)（HBV RT）準(zhǔn)種動態(tài)變化規(guī)律及其臨床意義。 方法 收集5例2014年11月～2017年12月期間在我院住院及門診應(yīng)用ETV初始治療（0.5 mg/d）應(yīng)答不佳的患者資料，留取各患者治療過程中基線、4周、12周、24周、36周和48周血清標(biāo)本凍存于-70℃?zhèn)溆?，并檢查生化指標(biāo)、血清學(xué)指標(biāo)、HBV DNA水平等。提取HBV DNA，PCR法擴增HBV RT區(qū)，HBV-DNA≥1E+04 IU/mL的模板直接擴增，HBV DNA<1E+04 IU/mL的模板，應(yīng)用巢式PCR擴增。回收目的片段并進行T-A克隆，每個標(biāo)本挑取20～30個克隆，取鑒定為陽性的克隆測序，采用ClustalX 1.81軟件和NCBI BLAST工具，將HBV序列進行比對，分析其氨基酸替換形式及準(zhǔn)種分布情況。 結(jié)果 本實驗5例ETV應(yīng)答不佳患者治療過程中共檢出7種病毒株變異形式，分別是 rtM204I、rtM204IV、rtT184L、rtM204V+rtL180、rtM204I+rtL180M、rtM204I+rtL180M+rtT184L、rtM204V+rtL180M+rtT184L。各種病毒株所占比例在不斷發(fā)生變化，抗病毒之前野生株是絕對優(yōu)勢株，出現(xiàn)病毒學(xué)突破時，耐藥突變株成為種群中優(yōu)勢株。 結(jié)論 在ETV抗病毒藥物壓力下，CHB患者HBV RT區(qū)準(zhǔn)種分布處于動態(tài)變化中，準(zhǔn)種變化與ETV抗病毒藥物敏感性以及耐藥性密切相關(guān)。rtM204I/V+rtL180M+rtT184L是與ETV耐藥相關(guān)的主要變異模式。

[關(guān)鍵詞] 恩替卡韋；抗病毒；乙型肝炎病毒；準(zhǔn)種

[中圖分類號] R512.62 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）27-0016-06

[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes and their clinical significance of HBV RT quasispecies in chronic hepatitis B（CHB） patients with poorly initial response to Entecavir（ETV）. Methods The data of patients with poor response to initial treatment（0.5 mg/day） of ETV in the Outpatient and Inpatient Department of Hangzhou Xixi Hospital （Hangzhou Sixth People's Hospital） from November 2014 to December 2017 were collected. The serum samples at baseline， 4 weeks， 12 weeks， 24 weeks， 36 weeks， and 48 weeks were taken from each patient during treatment for cryopreservation at-70°C for further use. The biochemical indicators， serological indicators， HBV DNA levels and other indices were examined. The HBV DNA was extracted， and PCR was used for the amplification of HBV RT region. The template of HBV-DNA≥1E+04 IU/mL was amplified directly. The template of HBV DNA <1E+04 IU/ml was amplified by nested PCR. The target fragment was recovered and T-A cloning was performed. 20-30 clones were selected per specimen， and the clones identified as positive were sequenced. The HBV sequences were compared using ClustalX 1.81 software and NCBI BLAST tools. The amino acid substitution form and distribution of quasispecies were analyzed. Results In this study， 7 variants of the virus strains were detected during the course of treatment in 5 ETV poorly responding patients. They were rtM204I， rtM204IV， rtT184L， rtM204V+rtL180M， rtM204I+rtL180M， rtM204I+rtL180M+rtT184L， rtM204V+rtL180M+rtT184L， respectively. The proportion of various strains was constantly changing. Wild strains are absolute dominant strains before antivirus. In the event of a virological breakthrough， resistant mutants became the dominant strains in the population. Conclusion Under the pressure of ETV antiviral drugs， the quasispecies distribution of HBV RT region in CHB patients is in a dynamic change. Quasispecies changes are closely related to the sensitivity and drug resistance of ETV antiviral drugs. rtM204I/V+rtL180M+rtT184L is the main variant pattern associated with ETV resistance.

[Key words] Entecavir； Antiviral； Hepatitis B virus； Quasispecies

恩替卡韋（Entecavir， ETV）是環(huán)戊烯類抗病毒藥物，對HBV有較強的抑制能力，且有較高的耐藥屏障，被EASL和AASLD作為慢性乙型肝炎抗病毒治療一線推薦藥物之一。但隨著抗病毒治療時間的延長和治療群體的不斷擴大，臨床上ETV治療應(yīng)答不佳或無應(yīng)答的患者在逐漸增加。2005年我國的《慢性乙型肝炎防治指南》明確提出準(zhǔn)種概念[1]，是指HBV感染患者體內(nèi)形成的以優(yōu)勢株為主的相關(guān)突變株病毒群。準(zhǔn)種概念強調(diào)的是遺傳學(xué)上高度相關(guān)而又有微小不同，同時在自身免疫和外界因素的作用下群體的構(gòu)成又處于不斷的變化中，研究準(zhǔn)種群的動態(tài)變化，對于研究抗病毒藥物敏感性以及耐藥發(fā)生有關(guān)鍵性作用[2]。本課題應(yīng)用PCR-克隆-測序法對5例ETV抗病毒治療應(yīng)答不佳患者的HBV RT區(qū)的氨基酸替換形式及準(zhǔn)種分布情況進行48周動態(tài)分析，以探討HBV準(zhǔn)種群體在臨床常用的抗病毒藥物ETV治療過程中的動態(tài)變化規(guī)律及其臨床意義，為相關(guān)耐藥的早期發(fā)現(xiàn)提供更充分的理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 入組標(biāo)準(zhǔn) 選取5例2014年11月～2017年12月期間在我院住院及門診就診且符合《慢性乙肝防治指南》CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)的CHB患者，所有患者初始并規(guī)范服用ETV（0.5 mg/d）抗病毒治療。

1.1.2 應(yīng)答不佳的界定 抗病毒治療12周，HBV-DNA仍然>1E+3 IU/mL為應(yīng)答不佳；病毒學(xué)突破指乙肝患者接受核苷類似物治療時，在治療過程中HBV-DNA水平比最低值升高超過1 log10 IU/mL。

1.2 方法

1.2.1 HBV-DNA的提取及擴增 用QIAamp blood mini Kit提取5例CHB患者各觀察點的HBV-DNA。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增HBV RT區(qū)，對HBV-DNA≥1E+04 IU/mL的模板用PCR直接擴增，反應(yīng)體系設(shè)20 μL，根據(jù)文獻設(shè)計并合成HBV外側(cè)引物：正向5'-CCTCACCCATATCGTCAA-3'和反向3'-GAGCCACAAAGGTTCCAC-5'；內(nèi)側(cè)引物：正向5'-GACTCG-TGGTGGACTTCTCTCA-3'和反向3'-GCAAACCCCA-AAAGACCCAC-5'。反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，共循環(huán)35次。對于HBV DNA<1E+04 IU/mL的模板，應(yīng)用巢式PCR進行擴增。取第一輪的PCR產(chǎn)物1 μL為模板，反應(yīng)體系同樣設(shè)為20 μL，反應(yīng)條件同第一輪PCR。

1.2.2 克隆與測序 所有PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用QIAgen膠回收試劑盒回收含有目的DNA片段。取凝膠回收DNA 2 μL，DNA maker（QDL 2000）6 μL進行電泳，應(yīng)用Image Lab軟件計算凝膠回收DNA的濃度值。配置10 μL反應(yīng)體系，按照與PMD-19T載體0.5 μL的摩爾比為6：1加入凝膠回收產(chǎn)物進行T-A克隆。恒溫4℃過夜后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α大腸桿菌菌株。每個標(biāo)本隨機挑取20～30個圓形單克隆菌落，分別加入3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，取菌液2 μL 再次進行PCR鑒定，引物為：正向5'-GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3'和反向3'-GCAAACCCCAAAAGACCCAC-5'。反應(yīng)體系設(shè)為20 μL，反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，取鑒定為陽性的克隆菌液810 μL測序。序列峰圖用ClustalX 1.81軟件分析，序列采用NCBI BLAST工具進行比對。

2 結(jié)果

2.1 5例患者的一般情況

見表1。

2.2患者的HBV-DNA及ALT動態(tài)變化

本實驗共有5例治療12周時HBV-DNA未降至檢測下限的患者，隨訪至48周，有2例患者（患者1、5）在治療48周時HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，ALT下降至正常水平。有3例（患者2、3、4）在48周時出現(xiàn)病毒學(xué)突破，見圖1。

2.3 準(zhǔn)種動態(tài)變化分析

對5例患者的血清標(biāo)本均行PCR產(chǎn)物克隆測序，通過與GenBank中公布的標(biāo)準(zhǔn)病毒株序列進行比對，共檢出7種病毒株變異形式，分別是rtM204V、rtM204I、rtT184L、rtM204V+rtL180M、rtM204I+rtL180M、rtM204I+rtL180M+rtT184L、rtM204V +rtL180M +rtT184L。基線時，5例患者HBV RT區(qū)優(yōu)勢株均為野生株。

2.3.1 治療48周HBV-DNA轉(zhuǎn)陰患者的準(zhǔn)種演變 見表2?；颊?在ETV治療后病毒快速下降，治療第4周降至4.5log10 IU/mL，此時檢出rtM204I變異株，所占克隆比例為16%，后rtM204I變異株逐漸累積。至治療24周時rtM204I變異株所占克隆比例達(dá)到62%，且此時病毒載量升高至5log10 IU/mL，之后繼續(xù)ETV抗病毒治療，至治療48周HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，rtM204I變異株所占克隆比例逐漸減少至40%?；颊?在治療第12周時檢出rtM204V變異株，此時病毒載量下降為3log10 IU/mL，在此之后rtM204V變異株呈現(xiàn)出逐漸增多的趨勢，在治療24周、36周時，rtM204V變異株所占克隆比例分別為46%、50%，48周HBV-DNA轉(zhuǎn)陰時為68%，該患者在治療12周后病毒載量出現(xiàn)下降緩慢，反復(fù)波動在3log10 IU/mL，直到48周rtM204V變異株比例逐漸降低，HBV-DNA才降至檢測下限。此2例患者的HBV-DNA及準(zhǔn)種的后續(xù)變化趨勢，還在繼續(xù)隨訪中。

2.3.2 出現(xiàn)病毒學(xué)突破患者的準(zhǔn)種演變 患者2在ETV抗病毒治療之初病毒載量也快速下降，在治療第12周開始出現(xiàn)病毒載量下降緩慢，同時此時檢測出rtM204I突變株（42%），治療24周檢測出M204I、T184L突變株，所占比例分別為43%、26%，此時患者HBV-DNA出現(xiàn)輕度升高，繼續(xù)ETV抗病毒治療第36周時，該患者體內(nèi)檢測出rtM204I+rtT184L+rtL180M聯(lián)合突變株（48%），至治療第48周時聯(lián)合突變株替代野生株成為準(zhǔn)種中的絕對優(yōu)勢株，占比達(dá)100%，伴隨著該患者的病毒學(xué)突破及ALT上升?；颊?在整個治療過程中病毒均在下降，主要表現(xiàn)為病毒載量下降緩慢，到治療36周時病毒仍未降至檢測下限，分析治療過程中其準(zhǔn)種動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，該患者在第4周時體內(nèi)已檢出rtM204V突變株（11%），rtM204V+rtL180M、rtM204V+rtT184L+rtL180M聯(lián)合突變株在24周被檢出，占比分別為42%、15%，rtM204V+rtT184L+rtL180M在48周時成為絕對優(yōu)勢株，同時該患者出現(xiàn)病毒學(xué)突破?；颊?在治療前病毒載量較其他患者相對偏低，為5log10 IU/mL，但該患者在ETV抗病毒治療12周時病毒載量較治療前下降不到1log10 IU/mL，分析其準(zhǔn)種演變發(fā)現(xiàn)，該患者在治療12周時即出現(xiàn)了rtM204V+rtL180M聯(lián)合突變株，在HBV準(zhǔn)種中的克隆比例為8%，在治療36周檢測出rtM204V+rtL180M+rtT184L聯(lián)合突變株（50%），且在HBV準(zhǔn)種中的比例迅速累積，在治療48周出現(xiàn)病毒學(xué)突破時rtM204V+rtL180M+rtT184L聯(lián)合突變株所占比達(dá)91%，取代野生型毒株成為準(zhǔn)種群體中的絕對優(yōu)勢株。所有患者的氨基酸替換形式及準(zhǔn)種演變情況見表2。

3 討論

作為目前臨床一線推薦的抗病毒藥物之一，ETV能夠迅速抑制HBV-DNA復(fù)制，并能較好改善患者的病毒學(xué)、組織學(xué)、生化學(xué)進展，受到臨床醫(yī)師和患者的青睞，但是核苷（酸）類似物（NAs）也有其明顯缺點，就是此類藥物不能清除原始復(fù)制模板cccDNA，致使停藥之后不能持久抑制病毒，目前臨床抗病毒治療越來越趨于長期用藥，故臨床上出現(xiàn)ETV治療應(yīng)答不佳、無應(yīng)答甚至耐藥的患者也在逐漸增加[3]。且國內(nèi)外大量研究[4-5]顯示拉米夫定（LAM）經(jīng)治療出現(xiàn)病毒學(xué)突破的患者可產(chǎn)生rtM204V+rtL180M耐藥突變株，在此基礎(chǔ)上僅需要再增加一個耐藥位點就可進一步篩選出ETV耐藥株，從而導(dǎo)致ETV耐藥發(fā)生，治療失敗。這些都對ETV抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答提出新的挑戰(zhàn)。

病原微生物在其自身復(fù)制過程中，由于缺乏嚴(yán)密的校對功能或同時在宿主免疫壓力或抗微生物藥物的選擇壓力下，其核酸成分在少數(shù)位點上容易發(fā)生突變，這種突變的逐漸累積就會形成了不同的基因型。對感染某一病原體的患者，在相對較短的時間內(nèi)，核酸的突變不會構(gòu)成病原體基因型改變，但會造成基因序列的差別，這種差別即構(gòu)成病原體的準(zhǔn)種現(xiàn)象[6-7]。由于肝細(xì)胞壽命長，cccDNA作為模板穩(wěn)定的貯存在肝細(xì)胞中進行持續(xù)復(fù)制，每天可產(chǎn)生10個新病毒顆粒，且HBV反轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶缺乏3'-5'外切酶校對功能，使HBV在復(fù)制過程中容易出現(xiàn)堿基錯配。在這種高速率復(fù)制又高錯配率的情況下，造成HBV的高變異率，產(chǎn)生了很多變異株[8-11]，由此產(chǎn)生了HBV準(zhǔn)種的概念。

免疫或抗病毒藥物的選擇壓力下HBV準(zhǔn)種群會發(fā)生動態(tài)演變[12-13]，其中優(yōu)勢病毒株決定藥物敏感性。HBV準(zhǔn)種演變符合達(dá)爾文進化論，適者生存，在接受NAs藥物治療之前的CHB患者體內(nèi)HBV野生株是絕對優(yōu)勢株，抗病毒治療后，對藥物敏感的野生株逐漸受到抑制，含有耐藥突變的變異株逐漸發(fā)展成為準(zhǔn)種中的優(yōu)勢株，進而造成HBV種群整體藥物敏感性轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致HBV準(zhǔn)種群耐藥[14-17]。本研究觀察了5例ETV初始治療應(yīng)答不佳的CHB患者48周，用PCR-克隆-測序法分析其在治療過程中HBV RT區(qū)的氨基酸替換形式及準(zhǔn)種分布情況，研究結(jié)果提示，在治療初期HBV RT區(qū)幾乎全表現(xiàn)為野生型，在ETV抗病毒壓力下，各種病毒株所占比例不斷在發(fā)生變化。隨著抗病毒治療時間的延長，準(zhǔn)種群中的各種突變株也趨于復(fù)雜，部分病毒能良好適應(yīng)新的環(huán)境，并在新環(huán)境下逐漸累積，最終導(dǎo)致HBV-DNA出現(xiàn)了下降緩慢，甚至再次升高的現(xiàn)象，而出現(xiàn)病毒學(xué)突破時，耐藥突變株成為種群中優(yōu)勢株。同時在抗病毒治療過程中，由于HBV RT區(qū)基因突變，使得某些位點氨基酸被置換，從而導(dǎo)致病毒對ETV的敏感性下降，出現(xiàn)應(yīng)答不佳甚至病毒學(xué)突破。揭示了HBV準(zhǔn)種在恩替卡韋抗病毒壓力下HBV RT區(qū)準(zhǔn)種組成的動態(tài)變化。劉霖等[18]分析了1例拉米夫定（LAM）、ETV序貫治療出現(xiàn)2次病毒學(xué)突破的患者治療過程中準(zhǔn)種變化，發(fā)現(xiàn)該患者在LAM單藥治療68周發(fā)生病毒學(xué)突破時rtL180M+M204V聯(lián)合突變耐藥株為優(yōu)勢準(zhǔn)種（97%），再更換ETV繼續(xù)抗病毒治療后，rtLl80M+M204V突變株在治療108、120、144周時在HBV準(zhǔn)種群中的克隆比例分別為90%、77%和86%。治療168周（ETV治療72周）時，rtL180M+S202G+M204V的毒株比例升高至76%，在ETV治療96周時，該聯(lián)合突變株所占比達(dá)到88%，出現(xiàn)第2次病毒學(xué)突破，該研究揭示了準(zhǔn)種在LAM、ETV序貫治療過程中的動態(tài)演變，同時該患者兩次病毒學(xué)突破均發(fā)生在原來對藥物敏感的病毒株被耐藥株代替時，表明了HBV準(zhǔn)種組成與藥物敏感性之間的緊密聯(lián)系。秦艷麗等[19]檢測了阿德福韋酯（ADV）治療LAM耐藥患者HBV RT區(qū)準(zhǔn)種的分布情況，發(fā)現(xiàn)LAM耐藥發(fā)生時YIDD變異株為優(yōu)勢株（77.8%），更換為ADV繼續(xù)抗病毒治療后，48周時在該患者體內(nèi)檢測出rtA181S變異株成為優(yōu)勢株（60%），且YIDD變異株逐漸消失，在治療96周再次發(fā)生病毒學(xué)突破時rtA181S/V+rtN236T和A181S變異株所占比例升高至90%。該結(jié)果說明HBV準(zhǔn)種在LAM-ADV序貫治療過程中組成變化。Tong J等[20]觀察了2例ETV治療出現(xiàn)病毒性突破的CHB患者3年，對其準(zhǔn)種進行研究，發(fā)現(xiàn)在治療48周時即已經(jīng)出現(xiàn)L180M+rtM204 V/I變異株，野生株仍然是優(yōu)勢株，治療144周出現(xiàn)病毒學(xué)突破時rtM204V/I+rtL180 M+S202G成為絕對優(yōu)勢株（79%），說明在ETV抗病毒治療壓力下HBV準(zhǔn)種的動態(tài)變化。Wang F等[21]分析了1例先后應(yīng)用LAM、ADV、ADV+替比夫定（LDT）序貫治療的患者HBV RT區(qū)準(zhǔn)種演變，發(fā)現(xiàn)YMDD變異株在治療18周時發(fā)展成為優(yōu)勢株（79%），更換ADV治療4周后YMDD變異株逐漸消失，繼續(xù)治療至68周時rtN236T耐藥變異株成為優(yōu)勢株（59%），隨后加用LDT治療22周后rtN236T變異株消失。該結(jié)果也顯示了HBV準(zhǔn)種在核苷（酸）類似物抗病毒藥物壓力下HBV準(zhǔn)種的進化過程。本研究及以上研究可以發(fā)現(xiàn)，患者出現(xiàn)病毒學(xué)突破均發(fā)生在原來對藥物敏感的病毒株被耐藥株代替時，表明了HBV準(zhǔn)種組成與藥物敏感性之間的緊密聯(lián)系。慢乙肝的抗病毒治療仍然是一個長期過程，準(zhǔn)種動態(tài)演變提示我們在抗病毒治療過程中，發(fā)現(xiàn)長期使用核苷類似物抗病毒治療，但是病毒下降緩慢、甚至有反跳的患者，應(yīng)對其HBV準(zhǔn)種進行定期監(jiān)測。若能夠及時檢測到基因型耐藥，在尚未發(fā)生臨床耐藥前即更換抗病毒治療方案，可降低抗病毒治療失敗的風(fēng)險[22]。

同時本研究的3例ETV基因耐藥患者，出現(xiàn)病毒學(xué)突破時的變異模式是rtM204I/V+rtT184L+rtL180M，與國內(nèi)外已有的研究一致。有關(guān)恩替卡韋的耐藥位點，2008年APASL會議《慢性乙型肝炎管理指南》中正式提出至少有3個位點的堿基置換才能構(gòu)成有臨床意義的ETV耐藥，即M204V/I和L180M再加上以下任何一個ETV耐藥位點T184、S202和（或）M250[23]。其中rtT184L主要存在于B、C基因型的HBV中，而我國的HBV患者以B、C基因型為主，所以rtT184L很可能是我國HBV患者rt184位點的主要變異類型。

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（收稿日期：2018-05-28）