周欽茂 謝燕純 陳彥梅 張揚(yáng) 柯德森 陳瓊?cè)A

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510000）

瓊膠是從紅藻中提取的親水性海藻多糖，由瓊膠糖和硫瓊膠組成［1］。由于瓊膠具有優(yōu)良的凝膠、增稠和穩(wěn)定性能，常被用于制作增稠劑、凝固劑、保鮮劑等，廣泛應(yīng)用于食品、日用化工、輕工、醫(yī)藥等領(lǐng)域中［2］；但是，由于瓊膠黏度高，水溶性差，難以被吸收，在應(yīng)用方面也受到很大限制［3］。然而，由瓊膠水解得到的瓊膠寡糖（主要由瓊二糖的重復(fù)單位連接而成，分為瓊寡糖和新瓊寡糖兩個(gè)系列）卻具有水溶性高，易被吸收的特點(diǎn)，具備良好的抑菌、增殖腸道益生菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫、吸濕保濕、美白和對(duì)植物病害防治等藥理作用和生物活性，是一種新型海洋功能性低聚糖，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，具有極大的開發(fā)潛力［4-6］。目前利用瓊膠來(lái)獲得低分子量的瓊膠寡糖多采用生物酶法（瓊膠酶）和化學(xué)法（酸水解），其中化學(xué)法處理無(wú)法精確控制水解度，而且后期的分離純化過程非常繁瑣，還會(huì)導(dǎo)致生成的瓊膠寡糖喪失生物活性，具有很大的局限性；而生物酶法作用環(huán)境十分溫和，降解過程易控制，產(chǎn)物專一且易于分離純化，工藝環(huán)保高效［7-9］。因此，運(yùn)用瓊膠酶降解瓊膠制備瓊膠寡糖已成為瓊膠工業(yè)高值化研究的重要方向。

瓊膠酶是能夠降解瓊膠的水解酶，分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。α-瓊膠酶裂解瓊脂糖的 α-1，3糖苷鍵，生成以3，6-內(nèi)醚-α-L半乳糖為還原性末端的的瓊寡糖系列；β-瓊膠酶裂解瓊脂糖的 β-1，4 糖苷鍵，生成以β- D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖系列［10］。迄今為止，瓊膠酶主要通過海洋微生物獲得，因此，獲得具有開發(fā)前景的菌株是開發(fā)微生物瓊膠酶的前提，目前人們已經(jīng)從海水系統(tǒng)中分離到了多種產(chǎn)瓊膠酶菌株，包括假單胞菌屬［11］（Pseudomonas）、假別單胞菌屬［12］（Pseudoalteromonsa）、鏈霉菌屬［13］（Streptomyces）、別單胞菌屬［14］（Alteromonas）、不動(dòng)桿菌屬［15］（Acinetobacter）、弧菌屬［16］（Vibrio）和船蛆桿菌屬［17］（Teredinibacter）等。但是普遍存在的問題是這些菌株所產(chǎn)瓊膠酶活性低，多數(shù)報(bào)道的菌株產(chǎn)瓊膠酶活力在 10 U 以下，降解瓊膠能力普遍不高，遠(yuǎn)未能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)瓊膠寡糖的需求［18］。目前只有Sigma公司從大西洋假單胞菌中分離的β瓊膠酶應(yīng)用于生產(chǎn)，且價(jià)格十分昂貴，應(yīng)用范圍大多僅限于科研工作中，這嚴(yán)重阻礙了瓊膠酶及瓊膠寡糖的開發(fā)應(yīng)用［19］。

廣東省擁有豐富的海藻資源，近年來(lái)海藻養(yǎng)殖方面也取得了很大進(jìn)展，但在開發(fā)利用方面還比較薄弱，存在很大的資源利用空間。因此，本研究選擇富含瓊膠的海洋龍須菜做為瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離對(duì)象，通過多種不同的篩選培養(yǎng)基，從龍須菜中分離產(chǎn)瓊膠酶菌株，并對(duì)得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rRNA 基因序列分析及發(fā)酵產(chǎn)酶研究，旨在獲得瓊膠酶高產(chǎn)菌株，為瓊膠酶及瓊膠寡糖的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 龍須菜樣品于2016年8月采自廣東省南澳島海域。

1.1.2 主要試劑和儀器 K2HPO4，KCl，MgSO4·7H2O，牛肉膏，酵母浸膏，海鹽，D半乳糖，碘化鉀，3-5二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉（上海生工生物工程有限公司），α-pNPG 和 β-pNPG（Macklin 公司）。

7230G紫外-可見分光光度計(jì)（上海諾科），SX-500高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy公司），PB-10 pH計(jì)（Sartorius公司），BS423S天平（Sartorius公司），BCD-563WY-C對(duì)開門冰箱（Haier 公司），SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（Airtech公司），ETC 811 PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），弧菌科細(xì)菌生化鑒定盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 x半海水培養(yǎng)基［20］（g/L）：蛋白胨6，瓊脂粉15，K2HPO41，KCL 0.5，MgSO4.7H2O 0.5，人工海水配制，pH 7.2左右；2216E培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，酵母膏1，瓊脂粉15，磷酸高鐵0.01，人工海水配制，pH 7.6-7.8；改良培養(yǎng)基［21］（g/L）：MgSO4.7H2O 0.1，F(xiàn)eSO40.1，（NH4）2SO42，K2HPO47，KH2PO43，瓊脂粉15，人工海水配制，pH 7.2；富集培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂粉2，蛋白胨10，酵母膏10，NaCL 20，pH 6.5；斜面培養(yǎng)基：同x半海水培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：蛋白胨6，瓊脂粉10，K2HPO41，KCL 0.5，MgSO4.7H2O 0.5，人工海水配制，pH 7.2左右；發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)瓊膠酶菌株分離和篩選 在廣東省南澳島采集龍須菜樣品，分別通過均質(zhì)法和振蕩法處理樣品后，取懸液接入富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，將富集培養(yǎng)的菌液進(jìn)行 10-1-10-4逐級(jí)稀釋，取 10-3、10-4兩個(gè)稀釋度的菌液涂布平板，27℃恒溫培養(yǎng)18-24 h。用接種環(huán)挑取不同菌落進(jìn)行平板分區(qū)劃線，重復(fù)操作直至得到純化菌株。滴加盧戈氏碘液，觀察是否產(chǎn)透明圈，以此判斷純化菌株是否產(chǎn)瓊膠酶。選取透明圈較大的菌株，挑取相應(yīng)的菌苔3環(huán)，接入裝有60 mL 種子培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h后以3%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h后以5 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液即粗酶液進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

1.2.2 瓊膠酶活力的測(cè)定 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：準(zhǔn)確稱取100 mg 半乳糖，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶定容，得到濃度為l mg/mL的半乳糖溶液。取9 支25 mL 具塞試管，按照表1內(nèi)容加入試劑，混合均勻后沸水浴5 min，冷卻至室溫，將其定容到25 mL，隨后對(duì)混合液540 nm 處的吸光值進(jìn)行測(cè)定，然后根據(jù)吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）DNS法測(cè)酶活：參照朱慧文、孫延娜等的方法［22］，采用DNS法測(cè)酶活：配制底物，加熱煮沸，待瓊脂全部溶解后取出置于50℃水浴鍋中緩慢降溫。將發(fā)酵液在5 000 r/min下離心20 min 后分別取粗酶液1 mL加入4支25 mL具塞試管中，1支作為空白對(duì)照組，另外3支為實(shí)驗(yàn)重復(fù)組。在空白組中加入1.5 mL DNS溶液鈍化瓊膠酶，將全部試管置于50℃水浴鍋中水浴保溫10 min。各吸取底物溶液（0.3%瓊脂配制）1 mL，加入4根試管中，充分混勻后于50℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。DNS各1.5 mL，分別加入至實(shí)驗(yàn)組的3根試管中以終止反應(yīng)，50℃水浴保溫10 min。取出試管，沸水浴 5 min后立即冷卻至室溫，，用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻后，于540 nm 處測(cè)吸光值。以煮沸滅活酶液為對(duì)照，用半乳糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酶降解底物產(chǎn)生的還原糖的量。瓊膠酶的活力定義為：在上述反應(yīng)條件下，1 mL酶液1 min產(chǎn)生l μg還原糖作為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

表1 半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

瓊膠酶活力（U/mL）= 半乳糖含量（mg）×1 000×粗酶液（mL）×稀釋倍數(shù) / 反應(yīng)體系中酶液加入量（mL）×?xí)r間（min）

1.2.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 將菌株在平板培養(yǎng)基上劃線接種，采用肉眼觀察菌落形態(tài)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［23］進(jìn)行染色，觀察菌體的單染色、革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和莢膜染色等結(jié)果，利用弧菌科細(xì)菌生理生化鑒定盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）鑒定菌株的生理生化特性。

1.2.4 16S rRNA基因序列的基因序列擴(kuò)增、比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析 采用煮沸處理法［24］對(duì)菌株進(jìn)行破壁處理，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行菌落PCR。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 2 min，94℃ 30s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè) 循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。使用Geneious軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序在GenBank上對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行相似性比對(duì)，分析比對(duì)結(jié)果，從比對(duì)結(jié)果中挑出相似性較高的菌株序列，使用 MEGA7.0的Neighbor-Joining（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.5 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的測(cè)定 以6%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r/min，28℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)，定期取適量發(fā)酵液測(cè)定600 nm下稀釋10倍的菌液的吸光度和發(fā)酵液的酶活力，繪制該菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線。

1.2.6 瓊膠酶類型的鑒定 參照Temuujin等［25］、馬芮萍和朱艷冰等［26］的方法，取400 μL 4 mg/mL的α-pNPG（對(duì)硝基苯基 -α-D-吡喃半乳糖苷）和 β-pNPG（對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）分別和1 mL 50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）混合均勻，40℃水浴預(yù)熱5 min，迅速加入1 mL粗酶液，混勻后40℃水浴加熱反應(yīng)1 h，加入1 mL 1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離篩選

2.1.1 初篩結(jié)果 從采集到的龍須菜樣品中共分離到18株產(chǎn)瓊膠酶的海洋細(xì)菌。通過滴加盧戈氏碘液觀察透明圈大小，測(cè)量比較透明圈內(nèi)外徑大小進(jìn)行初篩，得到8株產(chǎn)瓊膠酶能力較強(qiáng)的菌株。圖1是其中編號(hào)為D-5的菌株的盧戈氏碘液染色圖片，其菌落周圍形成較大的透明水解圈，說明該菌株具有較強(qiáng)的瓊膠降解能力。

圖1 菌株D-5在瓊脂平板上的碘液染色結(jié)果

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果 將初篩得到的8個(gè)菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h，分別測(cè)定其發(fā)酵液的瓊膠酶活力，測(cè)定結(jié)果見表2。由復(fù)篩結(jié)果可知，編號(hào)D-5的菌株酶活最高，故確定D-5為研究對(duì)象，將其命名為ZQM2017。

表2 復(fù)篩酶活對(duì)比

2.2 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

如圖2所示，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在大約1 500 bp處得到一條單一、明亮的條帶。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，拼接得到 1 453個(gè)堿基序列，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)為MG772935。將測(cè)序所得基因序列在NCBI上通過BLAST與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，菌株ZQM2017的16S rRNA 基因序 列 與Vibrio alginolyticus、Vibrio natriegens、Vibrio azureus、Vibrio azureus和Vibrio parahaemolyticus等細(xì)菌的序列相似性達(dá)到99%，將這些相似性較高的序列，通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3。

菌株ZQM2017的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中52株弧菌（Vibrio）的16S rRNA序列相似度達(dá)到99%，可以鑒定ZQM2017為一株弧菌，但由于ZQM2017與這些菌株的相似性過高導(dǎo)致構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹的bootstrap太小，仍需結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)將ZQM2017鑒定到種。

圖2 菌株ZQM2017 16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

菌株平板分區(qū)劃線結(jié)果和單染色鏡檢結(jié)果如圖4所示：該菌形成的菌落小，直徑0.43-1.56 mm不等，圓形，乳白色，邊緣整齊，質(zhì)地濕潤(rùn)黏稠，表面光滑，可被挑起，不透明。點(diǎn)接培養(yǎng)24 h后滴加盧戈氏碘液染色，測(cè)量得到透明圈內(nèi)徑（菌落直徑）約為3.6 mm，外徑（透明圈直徑）12.23-15.89 mm。

圖3 菌株ZQM2017系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 菌株ZQM2017形態(tài)學(xué)特征

挑取少量菌苔染色制片，單染色結(jié)果顯示該菌為短桿狀；革蘭氏染色結(jié)果顯示菌體呈紅色，判斷為革蘭氏陰性（G-）細(xì)菌；鞭毛染色結(jié)果顯示該菌為周生鞭毛；莢膜染色結(jié)果顯示該菌無(wú)莢膜；芽孢染色結(jié)果顯示該菌無(wú)芽孢。使用弧菌科細(xì)菌生化鑒定盒，經(jīng)培養(yǎng)觀察，得到ZQM2017和弧菌科常見菌種的部分生理生化指標(biāo)對(duì)照表（表3）。菌株ZQM2017的部分生理生化指標(biāo)和溶藻弧菌基本相符，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果，可將該菌鑒定為一株溶藻弧菌，命名為Vibrio alginolyticusZQM2017。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

半乳糖濃度在0-1.6 mg范圍內(nèi)，含量和反應(yīng)液在540 nm處的吸光值具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.521 8x-0.025（圖5）。

2.5 菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

由圖6可以看出，菌株Vibrio alginolyticusZQM-2017延滯期較短，在3 h時(shí)已經(jīng)結(jié)束延滯期；3-9 h屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在該時(shí)期內(nèi)生物量快速增加，相應(yīng)的酶活逐步上升；在9-35 h期間，該菌生物量開始下降且相對(duì)穩(wěn)定，進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定期，相應(yīng)酶活仍保持持續(xù)上升；在35 h以后，該菌生物量總體呈下降趨勢(shì)，可以判斷為衰亡期；在46 h時(shí)，生物量最低，相應(yīng)的酶活卻達(dá)到最大值為109.87 U/mL，在46 h以后酶活開始下降。

表3 Vibrio sp. ZQM2017與相近弧菌屬的生理生化特征

圖5 半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

出現(xiàn)酶活峰值可能是因?yàn)樵?6 h時(shí)，生物量最低，細(xì)菌裂解量達(dá)到最大，胞內(nèi)酶釋放，增加了粗酶液的酶活，使得總體酶活達(dá)到最大。在46 h以后，菌體裂解量增大，胞內(nèi)有機(jī)酸釋放，代謝產(chǎn)物不斷累積，導(dǎo)致酶活受到抑制，酶活性大小呈下降趨勢(shì)。由此可判斷，該菌株最佳發(fā)酵時(shí)間為46 h。

圖6 菌株ZQM2017生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

2.6 瓊膠酶類型的鑒定

利用Vibrio alginolyticusZQM2017菌株發(fā)酵所得的粗酶液分別與α-pNPG和β-pNPG反應(yīng)1 h，測(cè)定OD420，結(jié)果顯示，粗酶液和α-pNPG反應(yīng)后測(cè)得OD420為0.145，粗酶液和β-pNPG反應(yīng)后測(cè)得OD420為0.136。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Vibrio alginolyticusZQM2017所產(chǎn)瓊膠酶為混合型，同時(shí)含α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，且前者含量略高于后者，可以水解瓊膠得到瓊寡糖和新瓊寡糖。

3 討論

利用瓊膠酶水解瓊膠得到新型海洋功能性低聚糖——瓊膠寡糖是開拓海藻深加工及瓊膠寡糖開發(fā)利用的重要途徑，目前已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。分離篩選產(chǎn)瓊膠酶的微生物是獲取瓊膠酶的主要方法，但目前分離得到的微生物所產(chǎn)瓊膠酶活力普遍不高，遠(yuǎn)未能滿足工業(yè)化生產(chǎn)瓊膠寡糖的要求。如2014年，馬芮萍等［27］分離的Stenotrophomonassp.NTa.，優(yōu)化后的發(fā)酵酶活僅為1.98 U/mL；2014年，劉麗莉等［28］分離的新型產(chǎn)瓊膠酶海洋菌株Vibrio agarivoransZGR-26所產(chǎn)酶活為32.1 U/mL；2016年，曾誠(chéng)［29］分離的Thalassospirasp.fst-13007，發(fā)酵酶活最大僅達(dá)到2.76 U/mL；2016年，張林林等［30］分離的編號(hào)為A-001的海洋貝類腸道瓊膠降解菌株，酶活達(dá)到13.01 U/mL；2017年，張建美等［31］對(duì)分離到的產(chǎn)瓊膠酶弧菌Ag-1進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，得到最高酶活為45.51 U/mL。迄今只有Sigma-Aldrich有限公司從大西洋假單胞菌（Pseudomonasatlantica）中分離的β瓊膠酶應(yīng)用于生產(chǎn)，且價(jià)格十分昂貴，純度大于 5 000 U/mg 的產(chǎn)品，1 kU包裝的價(jià)格為 1 854.45元人民幣，目前應(yīng)用范圍僅限于科研工作中，這嚴(yán)重阻礙瓊膠酶及瓊膠寡糖、瓊膠低聚糖的開發(fā)應(yīng)用。

本研究篩選得到的海洋細(xì)菌Vibrio alginolyticusZQM2017在相同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酶能力處于較高水平，具有極大的開發(fā)潛力。若要進(jìn)一步提高菌株Vibrio alginolyticusZQM2017的產(chǎn)酶能力，可對(duì)該菌株進(jìn)行多方面如碳源、氮源、接種量、接種時(shí)間和酶解溫度等條件的綜合優(yōu)化，這將是后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展的方向。相信經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化，菌株Vibrio alginolyticusZQM2017的產(chǎn)酶能力會(huì)大大提高，為瓊膠寡糖的開發(fā)利用奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從廣東省南澳島海域采集到的龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）上分離得到18株瓊膠酶產(chǎn)生菌，從中篩選得到1株酶活最高的瓊膠酶產(chǎn)生菌ZQM2017。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和分子鑒定等手段，確定ZQM2017是一株溶藻弧菌。利用底物顯色法鑒定得到，該菌所產(chǎn)瓊膠酶為混合酶，同時(shí)含有α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，且前者含量略高于后者。通過初步優(yōu)化測(cè)酶活方法，測(cè)定該菌的產(chǎn)酶曲線、生長(zhǎng)曲線和pH曲線，初步了解該菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)，得到最佳發(fā)酵時(shí)間為46 h，初始酶活最高可達(dá)109.87 U/mL。