趙崇妍 楊 芳 屈青松 劉自堯 高鵬飛 史新元

(1 北京中醫(yī)藥大學生命科學學院,北京,102488； 2 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京,102488)

黃芪(Astragalusmembranaceus)是我國用量最大的中藥材之一，其活性成分包括黃酮、多糖、皂苷等[1]，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用[2-3]，在醫(yī)療保健領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。研究證實黃芪的主要活性物質(zhì)為黃芪總黃酮[4]。黃芪藥渣中仍含有活性成分，目前藥渣的處理方式主要是填埋、堆放、焚燒等，不僅造成環(huán)境污染，并造成了資源的浪費[5]。因此，亟需一種將藥渣高效、無害化的處理方式。

雙向發(fā)酵是將藥用真菌與中藥材配伍發(fā)酵的新型中藥炮制技術(shù)[6]。中藥材經(jīng)藥用真菌發(fā)酵后，可獲得一定的減毒、增效或擴用的效果[7]。蟬擬青霉(PaecilomycesCicadae)是麥角菌科擬青霉屬真菌寄生于蟬的若蟲后形成的復(fù)合體，即為我國傳統(tǒng)中藥蟬花[8]，其具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性[9-10]，蟲草酸是蟬擬青霉中的主要有效成分之一，常用作發(fā)酵蟲草類真菌菌絲體中活性成分的重要測試指標。我們以蟬擬青霉/黃芪和蟬擬青霉/黃芪藥渣為載體，建立雙向發(fā)酵體系，以蟲草酸含量為指標對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并測定發(fā)酵過程中有效成分含量的變化，以期增強黃芪藥材的藥用價值，提高黃芪藥渣的利用率，并為黃芪藥渣的高效處理提供新途徑。

1 材料

FW-100高速粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、LHS-80HC-Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、UV-2000紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋公司)、RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機(北京通輝金勝科技有限公司)。

乙酸銨(生產(chǎn)批號：20130314)、甲酸(SCIENTIFIC，Lot：F80L20)、硝酸鋁(生產(chǎn)批號：20120618)、亞硝酸鈉(生產(chǎn)批號：20110613)、高碘酸鈉(生產(chǎn)批號：20140306)試劑為分析純，購自北京化工廠；蘆丁標準品(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：PCS0724-1，純度≥98.0%)、蟲草酸標準品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99.0%)、黃芪甲苷Ⅳ標準品(上海中藥標準化研究中心，批號：0781-200210)。

蟬擬青霉(編號cfcc81169)由中國林業(yè)微生物保藏中心提供；黃芪飲片由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供；黃芪藥渣是以10倍量的蒸餾水對黃芪飲片進行2次提取，每次2 h[11]，過濾除去提取液后置于烘箱充分干燥所得。將黃芪及其藥渣打粉，備用。

2 方法

2.1 蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵體系的建立

2.1.1 菌種活化與液體培養(yǎng) 將蟬擬青霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基上，置于27 ℃、相對濕度80%的恒溫恒濕箱活化培養(yǎng)5 d備用。用接種環(huán)挑取活化后的蟬擬青霉置于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃、140 r/min培養(yǎng)7 d備用。

2.1.2 雙向發(fā)酵 分別稱取粉碎后的黃芪藥材及藥渣5 g，置于250 mL錐形瓶，加入蒸餾水6 mL浸濕藥材，121 ℃滅菌30 min備用。固體發(fā)酵瓶接種活化好的液體菌種后置于恒溫恒濕箱避光培養(yǎng)。

2.1.3 適應(yīng)性考察 以蟬擬青霉在基質(zhì)上的生長狀況和對基質(zhì)的消耗率為指標，判斷發(fā)酵組合的適應(yīng)性。若發(fā)酵后基質(zhì)的消耗率在20%左右，從發(fā)酵工藝上就可認為此發(fā)酵組合的設(shè)計是合理可行的[12]。

消耗率=(原藥材重量-干燥發(fā)酵后菌質(zhì)重量)/原藥材重量×100%

2.2 雙向發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1 正交設(shè)計 以蟲草酸為指標，采用三因素三水平正交試驗，對雙向發(fā)酵體系的接種量、發(fā)酵溫度及濕度進行優(yōu)化，因素水平設(shè)計見表1。發(fā)酵18 d終止，將藥材菌質(zhì)和藥渣菌質(zhì)產(chǎn)物于40 ℃干燥，粉碎稱重。測定發(fā)酵后產(chǎn)物的蟲草酸含量，進行直觀分析和方差分析，選擇出最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。

表1 正交試驗因素與水平表L9(34)

2.2.2 蟲草酸含量的測定 稱取干燥并粉碎后的菌質(zhì)1.0 g，加蒸餾水20 mL，沸水浴加熱回流提取2 h。冷卻后離心，取上清液定容至100 mL，即得樣品液。采用文獻[13]中的方法繪制蟲草酸標準曲線，得回歸方程為y=0.010 2x，R2=0.999 1，并測定蟲草酸的含量。每份樣品平行測定3次，結(jié)果取平均值[13]。

2.3 雙向發(fā)酵中成分含量的變化研究

取發(fā)酵第0、8、10、12、14、16、18、20 d的樣品，測定多糖、總糖、總黃酮和總皂苷的含量。

2.3.1 多糖及總糖含量的測定 提取黃芪菌質(zhì)、黃芪藥渣菌質(zhì)中的粗多糖和總糖[14-15]，并采用硫酸-苯酚比色法測定樣品粗多糖和總糖的含量，得回歸方程：y=14.266x+0.009 2，R2=0.9991。每份樣品平行測定3次，取平均值。

2.3.2 總黃酮含量的測定 采用70%乙醇回流提取樣品中的總黃酮，并利用NaNO2-A1(NO3)3比色法測定總黃酮含量[16-17]，得回歸方程：y=6.275x-0.024 5，R2=0.995 7。每份樣品平行測定3次，取平均值。

2.3.3 總皂苷含量的測定 采用70%的乙醇回流，并用飽和正丁醇萃取發(fā)酵菌質(zhì)中的總皂苷，采用香草醛-高氯酸氧化法測定發(fā)酵前后菌質(zhì)中總皂苷含量[18]，計算回歸方程：y=4.555 2x，R2=0.991 2。每份樣品平行測定3次，取平均值。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 雙向發(fā)酵組合適應(yīng)性考察 發(fā)酵4 d后，藥渣菌質(zhì)上首先長出了較多白色細絨狀菌絲體，藥材菌質(zhì)上的菌絲體略少于藥渣組，菌絲生長狀態(tài)良好。發(fā)酵第20天，發(fā)酵基質(zhì)表面及底部全部鋪滿濃密的菌絲體，菌絲顏色開始發(fā)黃，此時發(fā)酵終止。計算黃芪藥材和藥渣在發(fā)酵前后的重量變化，得出藥材菌質(zhì)比較未發(fā)酵前的消耗率為28.2%，藥渣菌質(zhì)為17.0%，所以認為該發(fā)酵組合從發(fā)酵工藝上是合理可行的。

3.2 雙向發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果 黃芪藥材菌質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件為a1b1c3，即接種量3 mL/5 g，溫度26 ℃，濕度90%。影響藥材菌質(zhì)的顯著性因素順序為b(發(fā)酵溫度)>c(相對濕度)>a(接種量)，因素a、b、c均有顯著性差異，因素b的差異性更為顯著，即溫度對發(fā)酵的影響更大。藥渣菌質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件為a1b1c2，即接種量3 mL/5 g，溫度26 ℃，濕度80%。影響藥渣菌質(zhì)的顯著性因素順序為b(發(fā)酵溫度)>c(相對濕度)>a(接種量)，溫度的影響更顯著于濕度和接種量。見表2～3。

表2 雙向發(fā)酵藥材菌質(zhì)與藥渣菌質(zhì)正交試驗極差

注：k1、k2、k3、R為藥材菌質(zhì)的k值和R值，k1*、k2*、k3*、R*為藥渣菌質(zhì)的k值和R值

表3 雙向發(fā)酵黃芪藥材菌質(zhì)和藥渣菌質(zhì)正交試驗蟲草酸含量因素

注：a、b、c為藥材菌質(zhì)各因素，a*、b*、c*為藥渣菌質(zhì)各因素

3.3 雙向發(fā)酵過程中成分的含量變化

3.3.1 發(fā)酵過程中菌質(zhì)多糖及總糖含量變化情況隨著發(fā)酵的進行，藥材菌質(zhì)與藥渣菌質(zhì)中總糖含量均降低，且下降趨勢逐漸趨于平緩，說明在發(fā)酵前期，蟬擬青霉生長迅速，到發(fā)酵后期蟬擬青霉的生長進入穩(wěn)定期，代謝緩慢。見圖1。藥材菌質(zhì)中多糖的含量隨發(fā)酵時間的推移逐漸下降，而藥渣菌質(zhì)的多糖卻在小幅升高后逐漸降低再升高。見圖2。

圖1 雙向發(fā)酵黃芪和黃芪藥渣菌質(zhì)中總糖含量

圖2 雙向發(fā)酵黃芪和黃芪藥渣菌質(zhì)中多糖含量變化

3.3.2 發(fā)酵過程總黃酮含量變化情況經(jīng)蟬擬青霉發(fā)酵后，黃芪藥材及藥渣菌質(zhì)的總黃酮含量均有提高，在發(fā)酵初期，由于菌體生長較快，總黃酮的含量顯著上升，發(fā)酵后期黃酮含量變化趨于平緩，這可能是由于菌體生長至穩(wěn)定期所致。見圖3。

圖3 雙向發(fā)酵黃芪和黃芪藥渣菌質(zhì)中總黃酮含量變化

圖4 雙向發(fā)酵黃芪和黃芪藥渣菌質(zhì)中總皂苷含量變化

3.3.3 發(fā)酵過程總皂苷含量變化情況 發(fā)酵后藥材菌質(zhì)中的總皂苷含量整體呈平緩的下降趨勢；藥渣菌質(zhì)初始總皂苷含量遠遠低于藥材菌質(zhì)，隨發(fā)酵進行皂苷含量先升高后降低。見圖4。

綜上所述，發(fā)酵黃芪藥材的最適宜濕度略高于發(fā)酵黃芪藥渣的濕度，但溫度對發(fā)酵體系的影響更大，因而在發(fā)酵中對溫度的精確控制更為重要。

4 討論

4.1 發(fā)酵條件優(yōu)化 我們以蟬擬青霉對發(fā)酵基質(zhì)的消耗率和生長狀況為指標，考察了蟬擬青霉/黃芪雙向發(fā)酵體系的適應(yīng)性。結(jié)果表明二者的組合合理可行。溫度對發(fā)酵菌體的生長代謝起到關(guān)鍵作用，正交實驗結(jié)果表明，溫度過高會影響蟲草酸產(chǎn)量，該結(jié)果與相關(guān)報道一致[19]。另外，雙向發(fā)酵的黃芪藥材菌質(zhì)和黃芪藥渣菌質(zhì)的最優(yōu)條件只有濕度有差異，這可能是由于藥材和藥渣基質(zhì)的保水能力差異所致。

4.2 成分含量測定 發(fā)酵過程中藥材菌質(zhì)和藥渣菌質(zhì)中總糖含量均下降，說明蟬擬青霉可利用黃芪藥材及藥渣中的糖類物質(zhì)作為生長所必須的C源。藥材菌質(zhì)與藥渣菌質(zhì)多糖含量變化趨勢的差異可能是由于藥材基質(zhì)中初始總糖的含量遠遠高于藥渣基質(zhì)，其可被蟬擬青霉直接利用的糖類成分較多，而在藥渣基質(zhì)中，蟬擬青霉需不斷代謝產(chǎn)生纖維素酶類物質(zhì)分解其中的纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)以維持正常生長。

黃芪中黃酮類化合物主要分為游離苷元和結(jié)合型糖苷2大類，是黃芪中分離的抗氧化清除自由基的主要活性成分，具有明顯的抗腫瘤、抗損傷和抗突變的作用[20]。我們通過測定發(fā)酵菌質(zhì)總黃酮的含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)蟬擬青霉發(fā)酵后，藥材及藥渣菌質(zhì)中總黃酮含量均有提升，且藥渣菌質(zhì)黃酮含量提升幅度遠遠大于藥材菌質(zhì)。在本研究蟬擬青霉與甘草渣的雙向發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)黃酮含量同樣出現(xiàn)了先升高后降低的變化，其可能的原因是蟬擬青霉不僅能合成黃酮類化合物同時還可分解黃酮類化合物。

皂苷極性較大易溶于水，因此發(fā)酵初始藥材基質(zhì)中的皂苷含量遠高于藥渣基質(zhì)。藥渣菌質(zhì)總皂苷含量在發(fā)酵過程中出現(xiàn)的先升高后降低的變化，可能是在雙向發(fā)酵過程中，黃芪藥渣菌質(zhì)產(chǎn)生的纖維素酶類物質(zhì)改善了黃芪藥渣細胞壁結(jié)構(gòu)，使皂苷提取率大大提升，隨著發(fā)酵的進行，皂苷又被逐漸分解。

綜上所述，該雙向發(fā)酵體系具有較大的應(yīng)用價值，雙向發(fā)酵增強了黃芪藥材的藥用價值，又為黃芪藥渣的再利用提供了可能，同時本方法也可為解決中藥工業(yè)所產(chǎn)生的大量草本類中藥藥渣的處理提供新思路。在后續(xù)工作中，還需對發(fā)酵過程中具體成分的變化進行分析，為其藥效研究奠定基礎(chǔ)。