五靈脂炮制前后指紋圖譜及含量測(cè)定比較

陳 瑩 聶 晶 龍小艷 向 陽(yáng) 黃志軍

(1 武漢理工大學(xué),武漢,430070； 2 健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,武漢,430052； 3 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,武漢,430075)

五靈脂為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠(TrogopterusxanthipesMilne-Edwards)的干燥糞便[1]，咸、甘、溫，歸肝經(jīng)，具有活血、散瘀、止痛功效，主要用于治療痛經(jīng)、血瘀經(jīng)閉、胃潰瘍、蛇蟲(chóng)咬傷等癥狀。五靈脂主要含有氮類(lèi)、三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、木質(zhì)素類(lèi)等成分[2]。五靈脂多為人工飼養(yǎng)鼯鼠收集糞便而得，陜西省商洛地區(qū)復(fù)齒鼯鼠養(yǎng)殖已成規(guī)模[3]。五靈脂的炮制方法包括4種：醋制、炒制、制炭、酒制，以醋制居多，2015年《中華人民共和國(guó)藥典》收載的以醋五靈脂投藥有7味[1]，以小金膠囊、小金丸、小金片等為主。五靈脂醋制能矯臭矯味，引藥入肝，增加活血止痛功能[4]。閔凡印以浸出物和尿素含量為指標(biāo)研究五靈脂炮制方法發(fā)現(xiàn)，醋拌勻悶一定時(shí)間0.5 h再炒至微干的方法，去除原藥異味，藥材外觀等方面均優(yōu)一于其他方法[5]。吳用瓊和李江東對(duì)傳統(tǒng)醋炙、酒炙五靈脂炮制方法進(jìn)行改進(jìn)，研制出醋酒炙法，以降低不良反應(yīng)，去除五靈脂的腥臊臭味[6-7]。

劉文粢對(duì)比五靈脂及其炮制品微量元素含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)炮制后五靈脂可降低原藥材中鋁的含量而減少毒性[8]，但未對(duì)不同炮制品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)五靈脂生品及其炮制品進(jìn)行研究，建立五靈脂生品及其炮制品指紋圖譜，并對(duì)五靈脂中穗花杉杉雙黃酮及扁柏雙黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，用以比較五靈脂生品及炮制品，闡明炮制對(duì)五靈脂化學(xué)成分的影響，為小金膠囊等中含醋五靈脂的制劑化學(xué)成分研究做鋪墊。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEX U3000液相色譜儀(美國(guó)戴安)，超聲波儀(LC-350 A型，濟(jì)寧中區(qū)魯超儀器公司)，電子分析天平(XS 204型、XP204型，梅特勒-托利多儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng))，密封型手提式粉碎機(jī)(CLF-40型，浙江溫嶺市創(chuàng)力藥用植物器械廠(chǎng))，Millipore超純水機(jī)。

1.2 試藥 穗花杉雙黃酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111902-201102)、扁柏雙黃酮對(duì)照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：B-051-B-16026)、黃酒(北京二商王致和食品有限公司，批號(hào)：20180114)、米醋(山西來(lái)福老陳醋股份有限公司，批號(hào)：20180209)、乙腈為色譜純(默克股份兩合公司)、甲酸為質(zhì)譜級(jí)，水為Millipore超純水、其他均為分析純。

1.3 分析樣品

1.3.1 五靈脂生品 17批五靈脂藥材均來(lái)自于陜西商洛養(yǎng)殖基地，經(jīng)肖凌副主任藥師鑒定為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠(TrogopterusxanthipesMilne-Edwards)的干燥糞便，藥材來(lái)源及批次見(jiàn)表1。

1.3.2 五靈脂炮制品 取前10批生品五靈脂進(jìn)行炮制，具體炮制方法如下：醋五靈脂：醋拌勻悶一定時(shí)間(約0.5 h后)再炒至微干，每100 kg五靈脂，用醋15 kg[5]，對(duì)應(yīng)醋五靈脂編號(hào)為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10。

酒五靈脂：同醋五靈脂，對(duì)應(yīng)酒五靈脂編號(hào)為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10。

清炒五靈脂：取五靈脂用文火炒至焦斑，或微黑色，放冷即可，對(duì)應(yīng)炒五靈脂編號(hào)為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9、Q10。

炭制五靈脂：取凈五靈脂置鍋內(nèi)用中火炒至黑色存性為度，取出，放涼即可，對(duì)應(yīng)炭五靈脂編號(hào)為T(mén)1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10。

表1 五靈脂批次

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent extend-C18(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.1%甲酸(B)為流動(dòng)相梯度洗脫，0～15 min，15%～24%A,15～20 min，24%～45%A，20～40 min，45%～50%A，40～50 min，50%～90%A，50～55 min，90%～15%A，55～60 min，15%A；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm；進(jìn)樣10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮各約5 mg，穗花杉雙黃酮加甲醇溶解并定容至10 mL，制成每1 mL含0.479 9 mg穗花杉雙黃酮儲(chǔ)備液，扁柏雙黃酮加1 mL二甲基亞砜先溶解再加甲醇定容至10 mL，制成每1 mL含0.5060 mg扁柏雙黃酮儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液制備 取五靈脂樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)約1 g，精密稱(chēng)定，分別置圓底燒瓶中，加90%甲醇50 mL，稱(chēng)重，回流提取30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用90%甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，濾液經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.4 五靈脂不同炮制品指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)五靈脂生品及炮制品，按“2.2.2”方法制備供試品，照“2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以5號(hào)峰為參照峰，9個(gè)共有峰(如圖1)的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.05%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)五靈脂生品及炮制品，按“2.3”方法制備供試品，照“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，在0、6、12、24、36、48 h測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以5號(hào)峰為參照峰，48 h內(nèi)6次進(jìn)樣所得圖譜的9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.14%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.78%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)五靈脂生品及炮制品各6份，按“2.3”方法制備供試品，照“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，以5號(hào)峰為參照峰，9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.05%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.4%，表明重復(fù)性良好。

2.6 五靈脂不同炮制品指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 將17批五靈脂生品及40批不同炮制品的色譜圖批樣導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》2012版軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以批號(hào)170713的生品或炮制品五靈脂為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)對(duì)照?qǐng)D譜生成法，時(shí)間窗口寬度為0.5 min，經(jīng)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配顯示五靈脂生品、醋五靈脂、酒五靈脂、炒五靈脂均檢出9個(gè)主要色譜峰，炭炒五靈脂顯示11個(gè)主要色譜峰，在保留時(shí)間13.35 min、24.89 min處新增T1，T2 2個(gè)峰，2、3、4、5峰的峰面積顯著降低，其中5，8號(hào)峰分別為穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮。見(jiàn)圖1、圖2。由軟件可以計(jì)算各樣品指紋圖譜與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似性系數(shù)，生品五靈脂相似度在0.959～0.999之間。醋五靈脂相似度在0.963～0.999之間，酒五靈脂相似度在0.977～0.999，炒五靈脂相似度在0.966～0.999，炭五靈脂相似度在0.967～0.997，表明每種炮制品檢出成分較為穩(wěn)定，差別較小。

2.7 五靈脂不同炮制品中穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量測(cè)定

2.7.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 取上述同等量穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮儲(chǔ)備液分別100 μL、100 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1 mL，加甲醇稀釋定容至100 mL、50 mL、25 mL、25 mL、25 mL，搖勻，各精密吸取10 μL，按上述色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量(X：ng)和峰積分面積(Y：微伏*s)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得穗花杉雙黃酮回歸方程Y=0.0138X+0.0036,R=0.999 2；扁柏雙黃酮回歸方程Y=0.0134X+0.0046，R=0.999 5，結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮進(jìn)樣量在4.799 ng～479.9 ng的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，扁柏雙黃酮進(jìn)樣量在5.060～506.0 ng的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批五靈脂粉末6份，按“2.3”制備供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，穗花杉雙黃酮RSD為1.73%，扁柏雙黃酮RSD為1.16%。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于0、6、12、24、36、48 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，穗花杉雙黃酮RSD為2.23%，扁柏雙黃酮RSD為0.90%。

2.7.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知含量的五靈脂粉末6份，約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入穗花杉雙黃酮對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL、扁柏雙黃酮對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，按供試品制備方法制備樣品，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮回收率分別為92.92%、103.26%，RSD值分別為1.24%、1.89%。

2.7.5 樣品含量測(cè)定 取所有樣品，按照“2.3”條方法制備供試溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)行分析，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算穗花杉雙黃酮(SHS)和扁柏雙黃酮(BB)含量。結(jié)果見(jiàn)表2，S、C、J、Q、T代表不同炮制方法；1、2、3、4、5等代表樣品編號(hào)。生品五靈脂穗花杉雙黃酮含量范圍0.0266%～0.0516%，扁柏雙黃酮含量范圍0.0443%～0.0804%；醋制品五靈脂穗花杉雙黃酮含量范圍0.0238%～0.0529%，扁柏雙黃酮含量范圍0.0353%～0.0718%；酒制品穗花杉雙黃酮含量范圍0.0247%～0.0512%，扁柏雙黃酮含量范圍0.0363%～0.0744%%；清炒五靈脂穗花杉雙黃酮含量范圍0.0230%～0.0494%，扁柏雙黃酮含量范圍0.0358%～0.0702%，炭炒五靈脂穗花杉雙黃酮含量范圍0.0109%～0.0269%，扁柏雙黃酮含量范圍0.0158%～0.0481%。由含量結(jié)果表明，炭制對(duì)五靈脂中穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量影響最為明顯，表現(xiàn)顯著降低；而其他炮制方法對(duì)穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量影響不明顯。

圖1 五靈脂生品

注：(A)醋五靈脂(B)酒五靈脂(C)清炒五靈脂(D)炭炒五靈脂(E)指紋圖譜共有模式

表2 五靈脂中穗花杉杉雙黃酮和扁柏雙黃酮百分含量測(cè)定結(jié)果(%)

圖2 不同炮制品HPLC指紋圖譜

注：5：穗花杉雙黃酮、8：扁柏雙黃酮、S：生五靈脂HPLC指紋圖共有模式、C：醋五靈脂、J：五靈脂、Q：清炒五靈脂、T：炭炒五靈脂

3 討論

3.1 提取條件的考察 實(shí)驗(yàn)比較了超聲和回流2種提取方式發(fā)現(xiàn)回流提取效率高；回流提取時(shí)間考察了30 min、1 h、2 h、3 h，結(jié)果表明，回流30 min后指標(biāo)性成分無(wú)明顯增加；比較乙酸乙酯、乙醇、甲醇、90%甲醇、80%甲醇等提取溶劑，結(jié)果90%甲醇提取穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮效率最高，提取溶劑用量選擇發(fā)現(xiàn)50 mL 90%甲醇提取較完全，故確定最佳提取條件為50 mL 90%甲醇回流提取30 min。

3.2 指紋圖譜分析 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)醋制、酒制、清炒五靈脂與生品五靈脂HPLC指紋圖譜相差不大，但通過(guò)氣味發(fā)現(xiàn)，醋制、酒制后減少了五靈脂腥臊惡臭味，說(shuō)明醋制、酒制、清炒對(duì)五靈脂的紫外吸收成分無(wú)明顯影響，但對(duì)揮發(fā)性成分影響較大，有待進(jìn)一步分析不同炮制品揮發(fā)性成分。炭炒五靈脂與生品五靈脂HPLC指紋圖譜差別較大，且有紫外吸收的成分含量明顯減少，可能與炮制溫度和時(shí)間有關(guān)，炭制溫度較高，且時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致化學(xué)成分發(fā)生變性，含量降低。

圖3 側(cè)柏葉

注：(A)五靈脂、(B)色譜圖

3.3 食物相關(guān)性 將五靈脂色譜圖與側(cè)柏葉色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，五靈脂9個(gè)共有峰均來(lái)自于側(cè)柏葉，為原形代謝產(chǎn)物，以穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮含量最高，據(jù)報(bào)道穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮有很強(qiáng)生物活性，有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤作用[9]，可能為五靈脂的活血成分之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)批號(hào)為170713和160325的五靈脂較其他批號(hào)五靈脂前3個(gè)峰較為明顯。見(jiàn)圖1中A圖S1、S13。與復(fù)齒鼯鼠的飼料側(cè)柏葉色譜圖比較發(fā)現(xiàn),這3個(gè)峰按色譜圖出峰順序分別為楊梅苷、槲皮苷、山奈素-3-鼠李糖[10]，表明此批號(hào)對(duì)應(yīng)復(fù)齒鼯鼠的吸收能力較其他批號(hào)差，具體對(duì)五靈脂活血活性影響有待考察。通過(guò)色譜圖比較可以大致區(qū)別側(cè)柏葉和五靈脂，側(cè)柏葉以2號(hào)峰(槲皮苷)為主，而五靈脂以5號(hào)(穗花杉雙黃酮)，8號(hào)(扁柏雙黃酮)峰為主，此方法可用于控制側(cè)柏葉加泥土的摻偽。