孫志軍,武 星,彭 暉,李衛(wèi)萍,李虹偉
(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院心臟中心,北京 100050)
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是目前導致人類死亡的主要疾病之一,糖尿病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要病因和危險因素,高血糖可以導致冠狀動脈舒張功能障礙,因此,糖尿病患者的心血管并發(fā)癥與血糖升高有著直接關系。血管細胞對高血糖的早期反應是產生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)。一氧化氮與O2·-在體內快速結合生成的過氧化亞硝基陰離子(ONOO-)是一種強氧化劑和硝化劑,可促使脂質過氧化、DNA鏈斷裂和蛋白質修飾。研究證實,高糖可損傷冠狀動脈電壓依賴性鉀離子通道,進而影響舒張功能;同時,冠狀動脈在高糖孵育下生成的ONOO-增加,給予尿酸清除ONOO-后,冠狀動脈舒張功能得以改善[1]。還有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠冠狀動脈管壁氧化負荷增加,減少氧化負荷可以改善冠狀動脈的舒張功能[1-3]。因此,探討何種細胞內信號傳導途徑參與高糖刺激下的冠狀動脈舒張功能受損,將為防治糖尿病心血管并發(fā)癥提供新的治療靶點。
RhoA/ROCK通路通過調控平滑肌收縮、細胞黏附、遷移、增殖和基因表達等,從而參與動脈粥樣硬化、高血壓、血管痙攣等的發(fā)生。研究顯示,糖尿病大鼠冠狀動脈的RhoA mRNA和蛋白表達均明顯增高,RhoA/ROCK通路參與了冠狀動脈平滑肌細胞舒縮調節(jié)作用[4-8]。因此,明確RhoA/ROCK信號通路是否參與高糖對大鼠冠狀動脈平滑肌細胞功能的損傷,將為臨床更全面地理解糖尿病的病理生理基礎,尋找更好的糖尿病靶器官損害的治療靶點提供一定的理論依據(jù)。
1.1實驗動物清潔級雄性Sprague Dawley大鼠30只,7~8周齡,體質量(200.0±20.0)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。
1.2主要試劑與儀器RhoA 一抗購自美國Bioworld公司,ROCK1一抗和ROCK2一抗購自美國SANTA公司,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗購自美國ProMab公司,Y-27632、C3轉移酶、4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)和佛司可林均購自美國Sigma公司;Powerlab生物信號采集分析系統(tǒng)購自澳大利亞亞埃德公司,DMT微血管環(huán)張力測試儀購自丹麥DMT公司。
1.3實驗方法
1.3.1大鼠冠狀動脈血管環(huán)的制備大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉,注射肝素抗凝,分離心臟后取直徑 ≤200 μm的小冠狀動脈,剪取長約2 mm的血管環(huán)備用。
1.3.2微血管環(huán)收縮舒張反應的測定將血管環(huán)分為正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組、高葡萄糖+Y-27632組,每組6個。各組血管環(huán)均在37 ℃條件下培養(yǎng)。正常葡萄糖組血管環(huán)給予5.5 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h;左旋葡萄糖組血管環(huán)給予5.5 mmol·L-1D-葡萄糖和17.5 mmol·L-1L-葡萄糖培養(yǎng)24 h;高葡萄糖組血管環(huán)給予23.0 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h;高葡萄糖+C3轉移酶組血管環(huán)給予23.0 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h,C3 轉移酶處理 16 h;高葡萄糖+Y-27632組血管環(huán)給予 23.0 mmol·L-1D-葡萄糖培養(yǎng)24 h,Y-27632預處理16 h。各組分別給予0.1、0.3、1.0、3.0 mmol·L-1的4-AP干預5 min,觀察血管環(huán)對4-AP的收縮反應;在3.0 mmol·L-1的4-AP使血管環(huán)達到最大收縮力后給予1 μmol·L-1血管舒張劑佛司可林,觀察血管的舒張反應變化(以給藥前后張力變化的百分比表示)。
小冠狀動脈的張力測定方法:將孵育后的冠狀動脈環(huán)各穿入2根直徑為40 μm的鎢絲,固定在Multi Myograph System-610M浴槽內傳感器上,通過微血管張力測試儀的換能系統(tǒng)自動采集血管環(huán)的張力變化。
1.3.3免疫組織化學法檢測5組大鼠小冠狀動脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達取制備好的大鼠冠狀動脈血管環(huán)分為正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組、高葡萄糖+Y-27632組,每組3個血管環(huán),各組干預措施同“1.3.2”項,行上述干預措施后取各組血管環(huán)制備石蠟切片。取各組石蠟切片二甲苯脫蠟2次,每次 5 min;浸入體積分數(shù)100%乙醇2次,每次 5 min;浸入體積分數(shù)95%、80%、70%、50%乙醇各 5 min;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗10 min。滴加體積分數(shù)3% H2O2+PBS孵育10 min;磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline-tween,PBS-T)清洗2次,每次3 min。滴加一抗100 μL,RhoA稀釋度1200;ROCK1稀釋度1200;ROCK2稀釋度1250),4 ℃過夜;PBS-T清洗2次,每次3 min。滴加二抗100 μL,室溫下二抗酶標結合反應10 min;PBS-T清洗2次,每次3 min。滴加100 μL 二氨基聯(lián)苯胺孵育5 min;蒸餾水沖洗5 min。蘇木精復染,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。對圖片中血管組織采用著色的平均光密度方法來代表RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白在血管組織中的平均表達水平。
2.1RhoA抑制劑(C3轉移酶)和ROCK抑制劑(Y-27632)對高糖刺激下大鼠冠狀動脈舒縮功能的影響各組大鼠小冠狀動脈對4-AP的收縮反應均呈濃度依賴性(圖1)。正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈對3.0 mmol·L-1濃度4-AP的收縮力分別為(3.15±0.31)、(2.08±0.17)、(1.37±0.22)、(2.13±0.09)、(2.02±0.16)mN。左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈的收縮力低于正常葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動脈的收縮力低于左旋葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高葡萄糖+C3轉移酶組、高葡萄糖+Y-27632組與左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動脈的收縮力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組、高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈的收縮力高于高葡萄糖組(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組與高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈收縮力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
正常葡萄糖組、左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈對佛司可林的舒張反應分別為(48.97±1.77)%、(39.47±1.32)%、(35.20±1.98)%、(39.80±1.59)%、(39.68±1.57)%。左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈的舒張反應均低于正常葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動脈的舒張反應低于左旋葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組與左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動脈舒張反應比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈舒張反應高于高葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組與高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈舒張反應比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
圖15組大鼠小冠狀動脈對4-AP的收縮反應
Fig.1Contractileresponseofsmallcoronaryarteryofratsto4-APinthefivegroups
2.25組大鼠小冠狀動脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表達結果見圖2和表1。左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中RhoA蛋白表達均高于正常葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中RhoA蛋白表達高于左旋葡萄糖組相,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組、高葡萄糖+Y-27632組、左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中RhoA蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組大鼠小冠狀動脈中RhoA蛋白表達低于高葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高葡萄糖+Y-27632組與高葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中RhoA蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高葡萄糖+Y-27632組與高葡萄糖+C3轉移酶組大鼠小冠狀動脈中RhoA蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
左旋葡萄糖組、高葡萄糖組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中ROCK1蛋白表達均高于正常葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高糖+C3轉移酶組與正常葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中ROCK1蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高葡萄糖組與左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中ROCK1蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中ROCK1蛋白表達顯著低于左旋葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中ROCK1蛋白表達水平顯著低于高葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組大鼠小冠狀動脈中ROCK1蛋白表達水平顯著低于高葡萄糖+Y-27632組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
左旋葡萄糖組、高葡萄糖組、高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中ROCK2蛋白表達均高于正常葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中ROCK2蛋白表達高于左旋葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高葡萄糖+C3轉移酶組、高葡萄糖+Y-27632組、左旋葡萄糖組大鼠小冠狀動脈中ROCK2蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中ROCK2蛋白表達水平低于高葡萄糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高葡萄糖+C3轉移酶組與高葡萄糖+Y-27632組大鼠小冠狀動脈中ROCK2蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
A:正常葡萄糖組;B:左旋葡萄糖組;C:高葡萄糖組;D:高葡萄糖+C3組;E:高葡萄糖+Y-27632組。
圖25組大鼠小冠狀動脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(蘇木精染色,×200)
Fig.2ExpressionofRhoA,ROCK1andROCK2proteininthesmallcoronaryarteryofratsinthefivegroups(hematoxylinstaining,×200)
表15組大鼠小冠狀動脈中RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達
組別nRhoAROCK1ROCK2正常葡萄糖組 30.175±0.0280.079±0.0070.068±0.002左旋葡萄組 30.249±0.023a0.239±0.005a1.265±0.071a高葡萄糖組 30.314±0.015ab0.218±0.019a3.410±0.048ab高葡萄糖+C3轉移酶組30.238±0.022ac0.099±0.012bc0.985±0.338ac高葡萄糖+ Y-27632組 30.273±0.009a0.163±0.011abcd1.562±0.131ac
注:與正常葡萄糖組比較aP<0.05;與左旋葡萄糖組比較bP<0.05;與高葡萄糖組比較cP<0.05;與高葡萄糖+C3轉移酶組比較dP<0.05。
Rho蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一,在細胞的信號傳導通路中作為分子開關,作用于細胞骨架或靶蛋白而產生多種生物效應[4]。Rho亞家族包括RhoA、RhoB和RhoC 3個成員。血管緊張素II、5-羥色胺、凝血酶、內皮素、血栓素A2、氧化型低密度脂蛋白、腫瘤壞死因子-α及白細胞介素1-β等均可以激活RhoA[5]。RhoA可以激活不同的下游效應器,參與平滑肌細胞收縮、細胞黏附、遷移、增殖和基因表達調控等,在不同的細胞信號傳導通路上發(fā)揮生物學作用。RhoA最重要的下游效應器為ROCK,其在細胞形態(tài)維持、收縮、遷移、黏附、分裂、增殖、凋亡和基因轉錄等基本活動中發(fā)揮重要作用[6]。ROCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,包括2種亞型:ROCK1和 ROCK2。有研究顯示,RhoA/ROCK信號通路在高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。高糖可以在系膜細胞[7]和血管平滑肌細胞[8]中激活Rho/ROCK 途徑。
有研究顯示,主動脈內皮細胞在高糖(23.0 mmol·L-1)條件下培養(yǎng) 6 h后,可明顯增加 RhoA 活性[9]。大鼠的內皮細胞在高糖培養(yǎng) 72 h后,可激活 RhoA/ROCK通路,并且這種激活可以被 GF109203X 逆轉[10]。研究顯示,高血糖可導致線粒體自由基的大量產生,增加 ROS的生成,促進活性氮自由基ONOO-的生成,從而產生毒性作用,引起血管張力和功能障礙[11]。研究表明,RhoA/ROCK通路參與了胰島素抵抗的調節(jié)和糖穩(wěn)態(tài)的維持[12-13]。
本實驗給予高糖孵育去內皮化的大鼠小冠狀動脈24 h,結果顯示,高葡萄糖組RhoA和ROCK2蛋白表達顯著增加。同時高葡萄糖組的小冠狀動脈舒張及收縮功能均顯著下降。而左旋葡萄糖組的RhoA、ROCK2蛋白表達顯著低于高葡萄糖組,且小冠狀動脈的舒張和收縮功能下降程度顯著低于高葡萄糖組。高葡萄糖+C3轉移酶組和高葡萄糖+Y27632組小冠狀動脈的舒張和收縮功能的下降程度也顯著低于高葡萄糖組,提示ROCK抑制劑可顯著改善高糖所致的平滑肌功能損傷。RhoA/ROCK通路的激活在很大程度上可能與高糖的刺激有直接關系,而RhoA/ROCK通路的激活導致了大鼠冠狀動脈平滑肌功能的受損,因此,推斷RhoA/ROCK信號傳導通路參與了高糖所致的大鼠冠狀動脈舒縮功能的受損過程。
C3轉移酶是從梭狀肉毒桿菌提取的一種生物毒素,可催化小三磷酸鳥苷結合蛋白Rho在41位天冬酰胺酸的單腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)核糖基化,而該位點是公認的Rho蛋白功能區(qū)域,因此,C3轉移酶引起的ADP核糖基化可使Rho蛋白失活,可作為RhoA的抑制劑[14]。吡啶類衍生物Y-27632是最常用的ROCK抑制劑,其可以滲透入細胞,結合到催化部位而抑制ROCK,有效抑制血管平滑肌細胞的ROCK,對血管平滑肌有明顯的舒張作用,可降低血壓。Y-27632 對ROCK的抑制特異性較其他蛋白激酶如蛋白激酶C、環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶以及肌球蛋白輕鏈激酶等的抑制能力高200倍[15]。
本實驗中分別用RhoA抑制劑C3轉移酶和ROCK抑制劑Y-27632進行預處理,結果顯示,該2組大鼠小冠狀動脈的收縮及舒張功能均較高葡萄糖組有顯著改善。因此,RhoA/ROCK 信號通路參與高糖致大鼠冠狀動脈舒縮功能損傷過程,表明其在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。